TERAPIA-GÊNICA apostila, Resumos de Genética

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SUMÁRIO

 - 1 A TERAPIA GÊNICA NO CONTEXTO MÉDICO E CIENTÍFICO - 2 PRIMÓRDIOS DA TERAPIA GÊNICA - 3 MODALIDADES DE TERAPIA GÊNICA............................................................... - 4 TERAPIA CELULAR, CÉLULAS-TRONCO E TERAPIA GÊNICA - 5 VETORES PARA TERAPIA GÊNICA - 5.1 Plasmídeos - 5.2 Vetores virais - 5.3 Vetores nanoestruturados - 6 APLICAÇÕES DA TERAPIA GÊNICA - 6.1 Doenças monogênicas - 6.2 Terapia gênica na cura da aids - 7 O BALANÇO RISCO-BENEFÍCIO DA TERAPIA GÊNICA 

• ADMINISTRAÇÃO E RISCOS ASSOCIADOS 8 TERAPIA GÊNICA FETAL: OBJETIVOS, VANTAGENS, POSSIBILIDADES DE - 9 TERAPIA GÊNICA NO BRASIL - 9.1 A Rede de Terapia Gênica - 9.2 Terapia gênica e biotecnologia no Brasil - 9.3 A Experiência com Seres Humanos e os Ensaios Clínicos no Brasil........... - 10 FUTURO DA TERAPIA GÊNICA
• ÉTICAS E JURÍDICAS......................................................................................................... 11 OS AVANÇOS TECNOLÓGICOS E CIENTÍFICOS E AS IMPLICAÇÕES
  • ética.................. 11.1 Implicações éticas: princípios e mecanismos de controle. Os Comitês de
  • preliminar................. 11.2 Consequências jurídicas. Princípios norteadores: uma abordagem
    • 12 RELEXÕES.
    • 13 BIBLIOGRAFIA...............................................................................................

Assim, para além das possibilidades futuras do tratamento ao nível de gene e de todos os avanços tecnológicos, na atualidade, esse tipo de terapia é muito complexo e carece de maiores desenvolvimentos das técnicas científicas, do entendimento de enfermidades, bem como de uma maior compreensão dos mecanismos de funcionamento dos genes. Seus custos econômicos e financeiros também são bastante elevados. Requer-se, deste modo, uma obediência maior aos preceitos éticos e jurídicos, a fim de garantir a vida e a integridade física e psíquica dos envolvidos no tratamento, bem como a sua viabilidade científica e econômica.

2 PRIMÓRDIOS DA TERAPIA GÊNICA

Desde sua fundação, pelo monge Johann (Gregor) Mendel no século XIX, aos dias de hoje, a genética evoluiu extraordinariamente e conquistou um lugar de destaque entre as ciências. Há dez anos foi completado o sequenciamento do genoma humano (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001), um feito grandioso que promete acelerar o progresso da biologia e da medicina do século XXI. A medicina moderna acrescenta, a cada dia, descobertas importantes em áreas de investigação destinadas ao desenvolvimento de novos paradigmas de tratamento para doenças ainda incuráveis. Entre elas, a expectativa de curar doenças genéticas repousa sobre a identificação de genes responsáveis por sua patogênese e sobre o avanço das tecnologias de DNA recombinante, ou "engenharia genética", que permitem a manipulação do genoma de forma cada vez mais eficiente e segura (Watson et al., 2006). Em paralelo, a determinação de fatores genéticos de suscetibilidade a certas doenças, seu curso e suas manifestações clínicas (NCBI, 2009), bem como o enorme avanço na compreensão da biologia celular e molecular

pesquisa, evitando-se escolher pessoas e populações vulneráveis para as pesquisas de maior risco e pessoas mais favorecidas para as pesquisas com maior benefício; 4) balanço risco/benefício favorável;

5. avaliação independente, efetivada por indivíduos alheios à pesquisa; 6) consentimento informado abrangendo: os objetivos e propósitos da pesquisa, riscos, benefícios e alternativas possíveis, a fim de que compreendam a informação e decidam de modo livre e voluntariamente; e 7) respeito pelos sujeitos inseridos na pesquisa, admitindo-se a possibilidade de renúncia, a proteção da privacidade, a informação dos riscos e benefícios descobertos no decorrer da pesquisa, bem como dos resultados da mesma, e vigilância contínua do seu bem estar. EMANUEL, Ezekiel. O que faz que a pesquisa clínica seja considerada ética? Sete requisitos éticos fundamentais. In Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Departamento de Ciência e Tecnologia. Capacitação para Comitês de Ética em Pesquisa – CEPs/Ministério da Saúde/Ministério da Saúde, Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos, Departamento de Ciência e Tecnologia. – Brasília: Ministério da Saúde, 2006. 2 v. – (Série F. Comunicação e Educação em Saúde), p. 74/75.

de eventos patológicos fundamentais, tais como processos inflamatórios, distúrbios de proliferação e morte celular programada (Coleman & Tsongalis, 2009), aumentam a expectativa de que a manipulação do genoma possa vir a ser aplicada a uma ampla gama de doenças. Essa é uma área ainda incipiente da medicina, praticada especialmente nos laboratórios de pesquisa fundamental, e sua aplicação ainda é estritamente experimental. Já há nessa área produtos comerciais aprovados para uso médico (Pearson et al., 2004), mas a expectativa dos cientistas, bem como da indústria farmacêutica e de biotecnologia, é de que a liberação de protocolos de manipulação do genoma para a prática médica e o respectivo mercado de biológicos deverão avançar cautelosamente ao longo dos próximos 5-10 anos, ainda assim englobando um número restrito de aplicações. Já em 1990, entretanto, uma equipe médica norte-americana tinha inserido um gene sadio no organismo de uma menina doente e a criança melhorou após esse tratamento. Começara uma nova era. A era da terapia gênica (ou terapia genética), ou seja, o procedimento destinado a introduzir em um organismo, com o uso de técnicas de DNA recombinante, genes sadios (nesse contexto denominados "genes terapêuticos") para substituir, manipular ou suplementar genes inativos ou disfuncionais (Linden, 2008). A partir da década de 1940, a genética tomou grande impulso, e descobertas sobre a natureza, composição química e as propriedades do material genético, bem como as primeiras manipulações do DNA de bactérias, começaram a gerar expectativas de novos avanços terapêuticos. Em meados da década de 1960, começou a especulação sobre a possibilidade de utilizar vírus para transferir genes a seres humanos doentes e curar doenças genéticas (Friedmann, 1997). Já naquela época, considerava-se tanto que os próprios genes de certos vírus pudessem fazer efeito quanto que fosse possível inserir genes humanos sadios em vírus para que esses os transferissem ao paciente. Entretanto, foi só no início da década seguinte que Paul Berg conseguiu de fato manipular uma molécula de DNA (Jackson et al., 1972), criando a tecnologia do DNA recombinante. Duas tentativas iniciais de aplicar na prática clínica o conceito de terapia gênica fracassaram, uma delas por se apoiar em uma premissa sobre propriedades de um vírus, a qual, mais tarde, se mostrou falsa (Rogers, 1952; Rogers & Rous, 1951;

no sangue das pacientes aumentaram progressivamente com a terapia gênica e se mantiveram estáveis no intervalo de descanso de seis meses (Blaese et al., 1995; Mullen et al., 1996). Finalmente, doze anos após terminarem as infusões, época em que foi feita uma reavaliação dos dois casos, grandes números de células T continuaram expressando o gene terapêutico no sangue da primeira paciente, cujo tratamento foi mais bem-sucedido do que o da segunda (Muul et al., 2003).

Fonte: pt.slideshare.net

Deve-se assinalar que ainda há questões técnicas relacionadas a esse estudo, que não permitem considerá-lo um completo sucesso clínico. Como as crianças continuaram a receber reposição da enzima, embora em doses menores, há dúvida sobre o quanto a terapia gênica terá de fato contribuído para que, por exemplo, a

primeira paciente esteja hoje, aos 24 anos de idade, saudável e ativa. No entanto, a partir das observações feitas ao longo do tratamento dessas duas primeiras pacientes, a terapia gênica para SCID-ADA evoluiu e hoje é considerada um sucesso clínico (Aiuti et al., 2009; Kohn & Candotti, 2009). Mesmo incipiente, o estudo iniciado em 1989, que obteve pelo menos alguns resultados positivos observando os requisitos éticos, é um marco na história da terapia gênica e inspirou o crescimento subsequente dessa área de investigação científica.

Histórico

1944 – O trabalho descrito por Oswald T. Avery e seus colaboradores, mostrou que é possível transferir genes de uma cepa bacteriana patogênica para outra não- patogênica, identificando o DNA como portador da informação genética. 1953 – James Watson e Francis Crick propõem a estrutura dupla-hélice do DNA. 1964 – Surge a hipótese de inserir genes saudáveis em indivíduos que deles necessitassem. 1969 – Isolamento do primeiro gene, por Jon Beckwith e colaboradores em Harvard. 1977 – Os pesquisadores Michael Wigler e Richard Axel conseguiram a primeira correção genética em células de mamífero cultivadas in vitro. Esses pesquisadores inseriram o gene que codifica a enzima timidina quinase em células portadoras de deficiência nesse gene. 1983 e 1984 - foram propostos os primeiros sistemas de vetores derivados de três espécies virais: retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados.

3 MODALIDADES DE TERAPIA GÊNICA

As etapas envolvidas em um experimento de terapia gênica são: o isolamento do gene, a construção de um vetor, a transferência para células no tecido-alvo, e a produção da proteína codificada e expressa pelo gene terapêutico nessas células.

que quase todo o genoma viral é removido para reduzir a resposta imune e aumentar o tamanho potencial de inserção.

Adenoassociados (precisam da presença de um adenovírus para a sua replicação) - integram o seu DNA ao cromossomo da célula hospedeira; podem transduzir células que não estão em divisão; não são capazes de transportar genes de dimensões grandes; são relativamente fáceis de se obter; produzem pouca resposta imune e têm pouco efeito patogênico; são capazes de manter a expressão terapêutica de meses a anos. Eles se tornaram muito mais populares como vetores de terapia gênica durante os últimos anos.

Lentivírus : são retrovírus RNA complexos que, diferente dos retrovírus simples, podem transduzir células que não estão em divisão através de poros na membrana nuclear. Os lentivírus podem se integrar com estabilidade ao genoma, e podem aceitar inserções razoavelmente grandes. Eles são atualmente o foco de muita pesquisa e desenvolvimento.

Vetores não-virais : um dos mais extensamente estudados é o lipossomo, um corpo adiposo que pode aceitar grandes inserções de DNA. Os lipossomos às vezes se fundem com células, permitindo que a inserção de DNA entre na célula. Como o lipossomo não tem peptídeos, ele não provoca uma resposta imune. Sua principal desvantagem é que ele carece da eficiência de transferência dos vírus: a maioria dos lipossomos é degradada no citoplasma. Também é possível inserir plasmídeos contendo DNA humano diretamente em células sem o uso de absolutamente nenhum vetor de transferência. Embora a maior parte do DNA “nu” seja repelida pela membrana celular, o DNA ocasionalmente entra na célula, escapa da degradação e codifica proteínas temporariamente. Ainda estão sendo feitas tentativas para usar o DNA “nu” como vacina. Está em desenvolvimento a síntese de cromossomos humanos artificiais. Como esses cromossomos sinteticamente construídos contem centrômeros e telômeros funcionais, eles devem ser capazes de se integrar e se replicar em núcleos de células humanas.

Transferência para células :

Procedimentos in vivo : consistem em transferir o DNA diretamente para as células ou para os tecidos do paciente.

Procedimentos ex-vivo : o DNA é primeiramente transferido para células isoladas de um organismo, previamente crescidas em laboratório. As células isoladas são modificadas e podem ser introduzidas no paciente. Este método apesar de mais demorado, é mais eficaz e oferece a possibilidade de selecionar e ampliar as células modificadas antes da reintrodução.

Os procedimentos de transferência do DNA in vivo ou em ex-vivo têm o mesmo propósito: o gene deve ser transferido para dentro das células, e uma vez inserido, tem que resistir bastante tempo. Neste tempo, o gene tem que produzir grandes quantidades de proteína para reparar o defeito genético. A ideia de usar as técnicas de DNA recombinante para corrigir o genoma foi inspirada nas doenças causadas por mutação em um único gene (ditas doenças monogênicas). Nesse caso, a ideia é substituir ou suplementar a expressão do gene disfuncional, mediante a inserção de uma ou mais cópias do gene terapêutico (Porteus

vacinas clássicas, ou curativa, levando o sistema imune a atacar os agentes agressores já instalados no organismo (Atkins et al., 2008, Sykes, 2008; Silva et al., 2009).

Fonte: pt.slideshare.net

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4 TERAPIA CELULAR, CÉLULAS-TRONCO E TERAPIA GÊNICA

Fonte:st3.depositphotos.com

As células-tronco são, atualmente, o principal assunto de natureza médica na mídia. Ao mesmo tempo, criou-se certa confusão entre células-tronco, terapias celulares e terapias genéticas. Nas chamadas terapias celulares, empregam-se células inteiras para tratar uma doença, com base nas propriedades regenerativas de células-tronco ou em outros efeitos, a maior parte dos quais ainda não explicados, das células transplantadas. O exemplo clássico, cuja fundamentação é bem conhecida, é o de leucemias, mas há expectativa de que muitas classes de doenças possam vir a ser tratadas com emprego de terapias celulares nos próximos anos (Torrente & Polli, 2008; Gribben, 2008; Einstein & Ben-Hur, 2008; Reffelmann et al., 2008). No presente contexto, é importante frisar que terapias celulares não envolvem necessariamente modificação genética. Já as terapias gênicas são baseadas na introdução ou modificação de genes. Isso pode ser feito diretamente in vivo, sem o auxílio de células inteiras do próprio paciente ou de doadores. Ou seja, terapia gênica e terapia celular são dois conceitos distintos. Entretanto, há métodos que combinam as duas técnicas. Um exemplo de combinação de terapia gênica com terapia celular foi, novamente, o procedimento ex vivo que inaugurou a terapia gênica, e que foi descrito antes. Novas tecnologias de terapia gênica para a SCID-ADA são baseadas na manipulação genética de células-tronco de medula

emprego de vetores plasmidiais é limitado a algumas circunstâncias, tais como sua introdução por injeção intramuscular, como no caso das vacinas de DNA ou no músculo cardíaco, ou ainda em estudos experimentais em animais. Outrossim, essa tecnologia pode ter aplicações importantes, por exemplo, para introduzir o gene sadio em células isoladas e combinar terapia gênica com terapia celular.

5.2 Vetores virais

Em contraposição à resistência da membrana celular à entrada espontânea de DNA em uma célula, os vírus são micro-organismos especializados exatamente em invadir células e nelas introduzir material genético. Contêm ácido nucleico (DNA ou RNA) cercado por uma capa de proteína e, em alguns casos, de um envelope adicional de proteína e lipídeos e seu ciclo de vida implica liberação do ácido nucleico viral na célula hospedeira. Essa propriedade é explorada para introduzir genes terapêuticos nas células, por meio de tecnologias de DNA recombinante. Alguns vetores são derivados de adenovírus. Essa família inclui quase 50 tipos distintos de vírus que causam, por exemplo, faringites ou conjuntivites. Infecções por adenovírus são muito comuns, e, por isso, a maior parte da população possui anticorpos contra um ou mais tipos dessa família de vírus. Outros são da família dos retrovírus, que inclui o HTLV causador de um tipo de leucemia e o HIV causador da Aids, que pertence à subfamília dos lentivírus, os quais vêm sendo muito estudados como fonte de vetores para terapia gênica. Ainda outros vetores são derivados de vírus da família dos adenovírus-associados, que não são patogênicos para seres humanos. O princípio da produção de vetores de origem viral para terapia gênica (figuras 2 e 3) consiste em remover os genes envolvidos nos mecanismos patogênicos e de proliferação viral, mantendo apenas o necessário para invasão das células sem multiplicação, seguida da inserção de um gene terapêutico no que resta do DNA viral (Machida, 2002). A remoção de genes que conferem o caráter patogênico e a multiplicação permite, por exemplo, que um vírus da mesma subfamília do perigoso HIV possa dar origem a um vetor viral útil para terapia gênica.

Fonte: scielo.br

Fonte: pt.slideshare.net

5.3 Vetores nano estruturados

Outra forma de introduzir DNA em células está sendo desenvolvida a partir de preparados obtidos por técnicas avançadas de nanotecnologia (Sanvicens & Marco, 2008). Aí se incluem polímeros que formam verdadeiras redes que prendem um gene e soltam sua carga quando penetram nas células, bem como vesículas de lipídeos contendo o DNA, capazes de fundir com a membrana das células, liberando seu conteúdo no interior destas últimas. Esses vetores podem ser enriquecidos com moléculas que ajudem a especificar em que tipos de células o conteúdo poderá penetrar, ou ainda permitam guiar ou transferir seletivamente os vetores de um compartimento para outro, por exemplo, do sangue para o cérebro (Pardridge, 2005, 2007, figura 4). Esta última técnica é importante, pois facilitará a terapia gênica cerebral sem a necessidade de uma neurocirurgia para introduzir o vetor, bastando injeções endovenosas.

Fonte: scielo.br

Ainda em outros casos, células modificadas pela introdução de um gene terapêutico podem ser encapsuladas em compartimentos produzidos a partir de polímeros inertes e, depois, introduzidas no organismo. A vantagem dessa técnica é que as células podem produzir e secretar moléculas terapêuticas enquanto ficam isoladas do sistema imune do paciente (Hauser et al., 2004; Lindvall & Wahlberg, 2008). Portanto, as células encapsuladas não precisam ser derivadas do próprio paciente.