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Tipologia: Notas de estudo
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Até a década de 70, o DNA era o componente celular mais difícil de ser
analisado. Sua sequência de nucleotídeos de enorme tamanho e monotonia química era
geralmente analisada por meios indiretos como a sequência de proteínas e análise
genética. A partir da década de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o
isolamento e a purificação de genes específicos num processo chamado de clonagem
gênica. Na verdade, muitas destas técnicas são provenientes da Microbiologia,
Bioquímica, Imunologia e Genética Microbiana e permitiram que a análise do DNA
ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se então, a molécula mais fácil de ser
analisada, sendo possível isolar regiões específicas, obtê-las em grande quantidade e
determinar a sua seqüência numa velocidade de milhares de nucleotídeos por dia.
A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este
conjunto de técnicas, tem uma ampla aplicação. Ela pode ser usada para estudar
mecanismos de replicação e expressão gênica, na determinação da seqüência de um
gene e conseqüentemente da proteína que ele codifica, ou no desenvolvimento de
culturas microbianas capazes de produzir substâncias úteis tais como a insulina humana,
hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua
aplicação comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inesgotável.
Como conseqüência do desenvolvimento desta tecnologia é atualmente possível
realizar investigação de paternidade e o diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas
através da análise de DNA.
A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana que considera uma
colônia de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente
idênticos à bactéria inicial.
A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular,
a qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A
clonagem molecular compreende pelo menos dois estágios importantes: primeiro o
Figura 1. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restrição. As setas indicam os sítios de
clivagem. As linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequência.
Estas enzimas reconhecem seqüências específicas de 4 a 8 pares de base (pb) na
molécula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. Há 2 tipos distintos de
clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica,
gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes são feitos simetricamente, porém, fora
do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas
conseqüências estão mostrados na Figura 1.
Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrição já foram identificadas. A
nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviação do nome do microrganismo do
qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a
espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da
descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrição
denominada de Eco RI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de
transferência de resistência RI, enquanto que a Hind III é isolada da Haemophilus
influenzae, linhagem d III.
A Tabela 1 mostra a seqüência palindrômica e o local de clivagem de algumas
enzimas de restrição. Note que algumas enzimas deixam terminações coesivas enquanto
que outras fazem cortes abruptos ou não coesivos.
a) C livage m no eixo de sim etria
M oléculas com extrem ida des a bruptas M oléculas com extrem ida des coe sivas
b) C livage m sim étricam e nte situada ao
redor do eixo de sim etria
...TC GA...
...AG CT...
3 ’
5 ’
3 ’
5 ’
...GAA TTC...
...CTT AAG...
3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’
Tabela 1. Algumas endonuclease de restrição: origem e sítios de clivagem. A seta indica
o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.
O interesse por estas enzimas de restrição aumentou em 1973 quando se
percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades
de fitas simples de DNA que permitiam a ligação dos fragmentos. Isto significava que a
recombinação poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Além disto, DNA bacteriano
poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espécie, abrindo a
possibilidade de clonar genes humanos ou isolar proteínas de culturas bacterianas.
Uma importante conseqüência da especificidade destas enzimas de restrição é
que o número de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo é
definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de
E sc h e r ic h ia c o li E c o R I
B a c illu s a m y lo liq u e fa c ie n s H
H a e m o p h ilu s a e g y p tiu s
H a e m o p h ilu s a e g y p tiu s
H a e m o p h ilu s a e g y p tiu s
P ro v id e n c ia s tu a rtii
S tre p to c o c c u s a lb u s G
T h e r m u s a q u a tic u s
S e r ra tia m a rc e sc e n s
B re v ib a c te riu m a lb id iu m
B a c illu s g lo b ig ii
B a m H I
B g l I I
P st I
B a l I
S m a I
H a e I II
Ta q I
S a l I
H in d I II
H a e I I
G A A T T C
C T T A A G
G G A T C C
C C T A G G
A G A T C T
T C T A G A
P G C G C P i
P i C G C G P
u
y u
A A G C T T
T T C G A A
C T G C A G
G A C G T C
G T C G A C
C A G C T G
T G G C C A
A C C G G T
A G G C C T
T C C G G A
C C C G G G
G G G C C C
T C G A
A G C T
fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos
de dois diferentes organismos (por exemplo, bactéria e homem) podem ser ligados por
renaturação das regiões de fita simples. Além disto, se a ligação for "selada" com a
enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos serão ligados
permanentemente.
A técnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de
DNA clivado for um plasmídeo.
Figura 3. Construção de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmentos de
diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição.
A figura 3 mostra uma molécula de DNA de plasmídeo que tem somente um sítio
de clivagem para uma determinada enzima de restrição. A mesma enzima é usada para
clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano são misturados com o DNA
plasmidial linearizado, permitindo a ligação entre eles, uma molécula de DNA
plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmídeo híbrido pode ser
inserido numa bactéria por transformação e então o inserto será replicado como parte do
plasmídeo. Geralmente antibióticos são acrescentados ao meio da cultura para selecionar
somente as linhagens que portam os plasmídeos (o plasmídeo usado para esta finalidade porta
resistência a pelo menos um antibiótico).
P lasm íd eo
de
E .coli
DN A hum ano
DN A liga se
P lasm íd eo híb rido
E nzim a E nzim a
GCA T
T ACG
TGCA TGCA
ACGT ACGT
T
G
C A
A
C
G T
T
G
C
A
T
G
C
A
A
C
G
T
A
C
G
T
Conforme mencionado anteriormente esta enzima promove a ligação dos fragmentos de
DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição. A DNA ligase requer
um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato
na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA
ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli
e de outras bactérias requer NAD
, enquanto que a isolada do bacteriófago T
requer
ATP como cofator.
Figura 4. DNA ligase cataliza a junção de duas fitas de DNA que são partes da molécula da
dupla-hélice.
Tipos de fragmentos de DNA que são ligados pela DNA ligase
a) Fragmentos com extremidades coesivas
As extremidades coesivas produzidas por várias enzimas de restrição permitem
dois fragmentos de DNA ligarem-se facilmente, através da formação de pontes de
hidrogênio pela complementariedade das bases. Finalmente a ligação covalente dos
fragmentos é realizada pela DNA ligase (ver figura 4).
b) Fragmentos com extremidade não coesivas
DNAs portando extremidades não coesivas são ligados com muito menos
eficiência que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma concentração muito maior
DNA 3’ DNA
OH
-
O P O 5’
O
-
O
DNA 3’ O O 5’ DNA
O
P
-
O
DNA-Ligase
AT P ou N A D
Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas em coesivas pela
adição de poli (A) e poli (T).
Figura 6. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformados em coesivas pela adição de
adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrição que reconhece o adaptador.
5’ 5’
3’ 5’ 5’
3’
AAAA TTTT
3’
3’
3’
AAAA TTTT
3’
3’
3’
5’ - E xonuclea se espe cífica
D eoxinucleotídio tran sferase te rm in al
E spaços p re enchido s com D N A P ol I. D N A ligase
para com pletar a ligação
+dATP +dTTP
DNA a ser inserido
GAATTC
CTTAAG
Adaptador
Sintético
T4 DNA ligase
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
Eco RI
AATTC
G
G
CTTAA
GAATTC
CTTAAG
Vetor
Eco RI
G AATTC
CTTAA G
6. TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
6.1.Conceito de transformação induzida
O processo de transformação constitui um evento de alta importância na técnica
de manipulação gênica. A transformação natural descrita por Griffith, em 1928, e por
Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro. No entanto em 1970, Mandel e
Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformação
com DNA exógeno, quando a bactéria foi suspensa em cloreto de cálcio gelado e
submetida a um curto choque térmico à 42
o
Estes mesmos autores também verificaram que as bactérias crescidas até a fase
log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estágios do crescimento.
O procedimento do cloreto de cálcio que é usado até hoje produz uma eficiência
de transformação de 10
a 10
transformantes por micrograma de DNA (a eficiência de
transformação é geralmente expressa como o número de células transformadas, obtido a
partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto).
O tamanho e a conformação da molécula do DNA, afeta o processo de
transformação. Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados pela célula
bacteriana competente, DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato de
sofrer degradação pelas enxonucleases presentes no espaço periplasmático.
6.2. Mecanismos de captação do DNA
O mecanismo de captação da molécula do DNA pela bactéria competente ainda é
desconhecido. Uma hipótese é que as moléculas do DNA passam através de canais
situados nas chamadas zonas de adesão, que são locais onde a membrana interna e
externa da célula bacteriana se unem formando poros. Estes poros só estão presentes
durante o crescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial).
Em condições naturais, a captação do DNA torna-se difícil, devido a repulsão
eletrostática existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipídeos da
membrana bacteriana com a carga negativa do grupo fosfato da molécula do DNA.
O papel do cálcio é explicado pela hipótese de que a 0
o
C a fluidez da membrana
celular é cristalizada, estabilizando a distribuição dos fosfatos carregados. Os íons Ca
formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas, facilitando
Atualmente, os tipos básicos de vetores usados na metodologia do DNA
recombinante apresentam características especiais que os tornam excelentes veículos de
clonagem em diferentes situações.
A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores atualmente em uso na
biologia molecular.
1. PLASMÍDEO
São pequenas moléculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessários
para a sua replicação e pelo menos um gene que confere resistência a antibiótico. Estes
elementos genéticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente
estão presentes em duas ou mais cópias por célula. Os plasmídeos presentes num grande
número de cópias são usados como veículos de clonagem desde que capacitem a
amplificação do segmento do DNA neles clonado.
Um plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes
propriedades:
a) possuir uma
origem de replicação (O), ou seja, uma seqüência de DNA que permita
que o vetor seja replicado na célula hospedeira,
b) apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para endonucleases de restrição. O
conjunto destes sítios é denominado de Múltiplo Sítios de Clonagem (MSC) é o local
onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem,
c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a célula transformada da
célula não transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene
que confere resistência à ampicilina (Amp
R
). As células transformadas com tais vetores
são capazes de crescer num meio contendo o antibiótico, enquanto que as células não
tranformadas acabam morrendo.
A figura a seguir ilustra as principais características estruturais de um
plasmídeo.
Figura 8. Estrutura molecular de um plasmídeo tipico usado em clonagem molecular
Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular é o uso de
enzima de restrição que produz extremidades compatíveis durante a clivagem do DNA a
ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor).
Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molécula híbrida deverá ser
introduzida numa célula hospedeira geralmente bactérias, por um processo chamado de
transformação, para que o vetor possa sofrer replicações e consequentemente amplificar
o número de cópias do inserto. A bactéria transformada será facilmente reconhecida
pela aquisição de um novo fenótipo dado pelo plasmídeo, ou seja, capacidade de crescer
em meios contendo antibiótico.
2. FAGOS
Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem molecular é o
denominado bacteriófago λλ, o qual comporta-se como um vírus da E.coli. Antes de
analisarmos o uso deste elemento como veículo de clonagem molecular, vamos mostrar
resumidamente as suas propriedades biológicas e estruturais.
2.1 Biologia do fago λλ
O fago λ é um parasita obrigatório da E.coli , o qual necessariamente deve
injetar o seu DNA na bactéria hospedeira para a sua multiplicação. Após a infecção da
E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias:
A m p R
O
M S C
As figuras 9 e 10 ilustram o ciclo biológico do fago λ em uma célula
hospedeira e o genoma do fago λ com alguns dos seus principais genes,
respectivamente.
Figura 9. Replicação do fago λ no interior da célula hospedeira. Após adsorção (1) e injeção
(2) do genoma do fago λ
na bactéria, a via lítica indicada pelos números 3, 4 e 5 leva a
formação de novas partículas virais. Alternativamente, a via lisogênica (6) pode ser ativada
levando à integração do material genético viral ao genoma da bactéria hospedeira .
Figura 10. Genoma do fago λ
2.3 Controle de expressão dos genes do fago λλ
Seja qual for a via a ser seguida pelo fago λ, ou seja via lítica ou lisogênica, a
expressão dos genes envolvidos nestes circuitos começa pelos produtos dos genes
e
1
2
6
3
4
5
E m pa cotam e nto R eco m b ina ção R eg u laçã o R ep licaçã o L ise
cos A J
N C ro
p L pr
.cIII cI cII O P S R
in t
Cro , regulados pelos promotores pL e pR respectivamente situados à esquerda ( pL ) e à
direita ( pR ) do gene cI.
Durante o transcurso da via lítica , o produto do gene cro está diretamente
relacionado com a replicação do genoma do fago λ, através da indução da expressão
dos genes
. Por outro lado, o produto do gene
está diretamente relacionado com a
expressão dos genes da região de empacotamento ou seja genes A e J , responsáveis pela
síntese das proteínas da cabeça e da cauda do fago λ como também da expressão dos
genes
e
, diretamente envolvidos com a lise da célula hospedeira.
Durante a via lisogênica , a transcrição também se inicia pelos promotores pL e
pR coordenando a expressão dos genes cII e cIII. O produto destes dois genes
coordena a expressão do gene cI que produz uma proteína repressora inibindo a
expressão dos genes responsáveis pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um
outro gene importante é o int cujo produto relaciona-se com a integração do fago no
genoma bacteriano estabelecendo o estado lisogênico.
2.4 O uso do fago λλ como vetor de clonagem molecular.
Durante o ciclo lítico, os genes envolvidos no processo de lisogênia são
dispensáveis e consequentemente a chamada região de integração do genoma do fago
pode ser totalmente substituída por um outro fragmento de DNA, sem que haja qualquer
alteração nos processos envolvidos na via lítica.
Uma das maiores vantagens de usar o fago λ como vetor de clonagem é que o
DNA inserido no fago é empacotado in vitro. Embora a eficiência de empacotamento
seja cerca de 10%, uma vez que os fagos são empacotados teremos 100% de eficiência
na infecção da E.coli hospedeira.
Este processo é altamente eficiente quando comparado com o da transformação
bacteriana com plasmídeos. Neste caso, os melhores resultados situam-se ao redor de
8
transformantes por μg de DNA o que significa que menos de 1 em 1000 plasmídeos
são transformados na E.coli hospedeira.
Outros derivados do fago λ são os chamados vetores de inserção, neste tipo de
vetor, os fragmentos de DNA que podem ser inseridos devem ter no máximo até 7kb de
tamanho para não alterar os processos de empacotamento do genoma do fago.
Os vetores de inserção derivados do fago
λ mais bem utilizados especialmente
na clonagem de cDNA, são os vetores
λ gt10 e o
λ gt11. Vamos a seguir fazer algumas
considerações sobre estes dois tipos de vetores.
No fago λgt10, o inserto geralmente cDNA é inserido no sítio da EcoRI situado
no gene repressor
cI
. O fago recombinante terá agora o gene
cI obstruído e
consequentemente produzirá durante a cultura, placas de lise com o centro claro
morfologicamente fácil de ser distinguida da placa não recombinante que possue o gene
cI íntegro e por conseguinte uma placa de lise turva.
Por outro lado, o fago λgt11 contém um sítio de restrição Eco RI localizado no
gene Lac Z, 53 pares de bases anterior ao código de término de expressão da enzima β
galactosidase. Quando o cDNA inserido no sítio da Eco RI contém sequências
codificadoras em fase de leitura com as sequências codificadoras do Lac Z, o cDNA
inserido é expresso como uma proteína fundida com a β-galactosidase. Esta expressão é
obtida na presença do IPTG (isopropil-β-D-galactosídeo) que é o indutor do promotor
Lac que juntamente com o substrato cromogênico X-gal irão produzir placas incolores
no caso do inserto estar presente e obstruir a expressão da enzima β-galactosidase, ou
placas azuis quando não há inserto e a enzima é expressa completamente ativa.
3. COSMÍDEO
A clonagem de fragmentos de DNA no fago
λ apresenta uma limitação na qual
o fragmento a ser clonado não ultrapasse cerca de 15kb (Figura 12). Na maioria das
vezes, esta dimensão é suficiente para conter um gene completo, incluindo as
sequências flanqueadoras. Entretanto, muitos genes apresentam dimensões da ordem de
35 a 40 kb e nestes casos, a técnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento é a
chamada clonagem em cosmídeos.
Os cosmídeos, são plasmídeos que contém um fragmento de DNA do fago λ
que inclue o sítio cos. Estes cosmídeos podem ser usados como veículos de clonagem
molecular empregando o sistema de empacotamento in vitro. Este sistema, reconstitue a
estrutura do fago (cabeça e cauda) e assim é usado para infectar a célula hospedeira.
As enzimas do sistema de empacotamento do fago
λ reconhecem dois sítios
cos
situados 35 a 49Kb de distância e neste caso, somente fragmentos desta ordem de
tamanho serão convenientemente empacotados.
O DNA genômico é clivado com uma enzima de restrição que produz grandes
fragmentos de DNA, os quais serão ligados ao cosmídeo, também clivado com uma
enzima semelhante.
A situação ideal é que cada fragmento do DNA genômico apresente um sítio
cos nas suas extremidades. Durante o empacotamento, as enzimas do sistema
reconhecem os sítios cos situados a uma distância dentro de 49Kb, clivam estes sítios e
empacotam estas moléculas.
O DNA do cosmídeo é injetado no interior da célula hospedeira, circulariza
igual ao DNA do fago e replica como um plasmídeo normal, sem expressão de qualquer
função do fago. As células infectadas serão selecionadas com base na resistência
adquirida a um determinado antibiótico. A figura ilustra um típico processo de
clonagem em cosmídeo.
