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Faculdade de Estudos Superiores Débora Tocafundo de Souza Marina Celeste Martins Rita de Cássia Lima Morais Sabrina Campos da Silva Suzielle Lorem Leonel Guimarães

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

• 2 -

Belo Horizonte 2010

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Débora Tocafundo de Souza Marina Celeste Martins Rita de Cássia Lima Morais Sabrina Campos da Silva Suzielle Lorem Leonel Guimarães

2010

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ÍNDICE

1 ..............................................................................................................................

2 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 2

3 PREPARAÇAO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCÓPICO..................................... 3

4 MICROSCOPIA DE LUZ........................................................................................... 7

5 MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA................................................................................................................. 8

6 MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO.......................................................................... 8

7 MICROSCOPIA CONFOCAL.................................................................................... 9

8 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA....................................................................... 9

9 MICROSCOPIA ELETRÔNICA.................................................................................. 10

10 ..............................................................................................................................

11 RADIOAUTOGRAFIA EM SECÇÕES DE TECIDOS..................................................... 12

12 CULTURA DE CÉLULAS E TECIDOS.......................................................................... 12

13 FRACIONAMENTO CELULAR.................................................................................. 13

14 HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA........................................................................... 13

15 DETECÇÃO DE MOLÉCULAS EM CORTES HISTOLÓGICOS POR MEIO DE INTERAÇÃO MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE .................................................................................. 17

16 PROBLEMAS NA INTERPRETAÇÃO DE CORTES...................................................... 21

17 CONCLUSÃO.......................................................................................................... 22

18 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 23

INTRODUÇÃO

O procedimento mais usado no estudo de tecidos ao microscópio consiste na preparação de cortes histológicos. No microscópio de luz (óptico ou fotônico) a imagem se forma após um feixe de luz atravessa alguma estrutura. Células vivas, camadas muito delgadas de células ou de tecidos, membranas transparentes de animais vivos podem ser observadas diretamente ao microscópio. No entanto, na maioria dos casos os tecidos e órgãos são espessos e não permitem a passagem adequada de luz para formação de uma imagem; antes de serem examinados no microscópio eles devem ser fatiados em secções muito delgados que serão colocados sobre lâminas de vidro. Os cortes são obtidos por instrumentos de grande precisão chamados micrótomos, mas antes os tecidos precisam passar por uma série de tratamentos que serão descritos a seguir:

• Fixação Células ou fragmentos de tecidos e órgãos, assim que retiradas do corpo, são submetidas a um processo de fixação. Ela tem várias finalidades: evitar a digestão dos tecidos por enzimas presentes nas próprias células (autólise) ou em bactérias; endurecer os fragmentos; preservar em grande parte a estrutura e a composição molecular dos tecidos. Pode ser feita por métodos químicos ou, menos freqüentemente, por métodos físicos. Na fixação química os tecidos são imersos em soluções de agentes desnaturantes ou de agentes que estabilizam as moléculas formando pontes com moléculas vizinhas (soluções chamadas de fixadoras). Como pode demorar para que os fixadores se difundam pelo interior dos fragmentos, é bom que a amostra seja cortada em fragmentos menores, facilitando a penetração do fixador no fragmento e garantindo uma melhor preservação da estrutura. Alternativamente, pode se usar a perfusão intravascular do fixador, alcançando a intimidade dos tecidos rapidamente pelos vasos sanguíneos, sendo a fixação melhor.

Um dos fixadores mais comuns para a microscopia de luz é uma solução isotônica tamponada de formaldeído a 4%. Formaldeído e glutaraldeído, outro fixador extensamente usado, são conhecidos por reagir com os grupos amina (NH2) das proteínas.

Devido à alta resolução oferecida pelo microscópio eletrônico, é necessário um cuidado maior na fixação para melhor preservar os detalhes da ultra- estrutura das células e da matriz. Para esta finalidade uma fixação dupla de glutaraldeído tamponado, seguida por uma segunda fixação em tetróxido de ósmio,

tornou-se um procedimento padrão para estudos ultra-estruturais. O efeito do tetróxido de ósmio é preservar e fornecer contraste aos lipídeos e proteínas.

• Inclusão Para obter secções delgadas com micrótomo os fragmentos de tecidos e órgãos devem, após fixação, ser infiltrados com substâncias que lhes proporcionem uma consistência rígida. É usada a parafina (para microscopia de luz) e algumas resinas de plástico (para microscopia de luz e eletrônica).

O processo de impregnar os tecidos com parafina é chamado inclusão ou embebição em parafina e geralmente é precedido por duas etapas: desidratação e clareamento. A água é extraída passando os fragmentos por diversos banhos de soluções de concentrações crescentes de etanol.

Após a desidratação o etanol presente nos fragmentos deve ser substituído por uma substancia intermediária que é miscível tanto em etanol como no meio que foi escolhido para inclusão (parafina ou resina). Para a inclusão em parafina a substância intermediária mais comumente usada é o xilol. Quando os fragmentos de tecidos são embebidos em solvente orgânico, eles ficam transparentes ou translúcidos.

A seguir, são colocados em parafina derretida e quente. O calor causa evaporação do solvente orgânico, e os espaços existentes dentro do tecido são preenchidos por parafina. Depois dos fragmentos serem retirados da estufa a parafina solidifica e torna-se rígida.

Os blocos de parafina são então levados ao micrótomo, onde são seccionados por uma lâmina de aço ou de vidro de modo a fornecer cortes de 1- micrômetro. Após serem seccionados, os cortes são colocados para flutuar numa superfície de água aquecida e depois colocados sobre lâminas de vidro, onde aderem e onde serão depois corados.

• Fixação física por congelação

(como porções do citoplasma rica em RNA e matriz da cartilagem hialina). A eosina cora o citoplasma e o colágeno em cor - de rosa. São usados também os tricrômicos (como os corantes de Mallory e de Masson), mostra bem o núcleo e o citoplasma, ajudam a diferenciar colágeno e músculo liso entre si. Uma técnica boa pra diferenciar colágeno é o uso do picro-sirius associado com luz polarizada. Em muitos procedimentos as estruturas são evidenciadas por um precipitado ou por um corante fluorescente, mas as células e os seus limites não são visíveis. Neste caso é usado um contratransporte – trata-se de um corante aplicado a um corte para permitir a visualização dos contornos das células ou núcleos. Uma outra maneira de evidenciar componentes de células e tecidos é a sua impregnação por metais, como prata e ouro, método comum para estudar tecido nervoso. O procedimento inteiro pode demorar de 12 h à dois dias, dependendo do tamanho do tecido, do fixador e do meio de inclusão utilizados.

MICROSCOPIA DE LUZ

No microscópio de luz, as preparações coradas são examinadas por iluminação que atravessa o espécime. O microscópio é composto por partes mecânicas e ópticas. O componente óptico tem três lentes: condensadora, objetivas e oculares. O condensador concentra a luz de uma lâmpada e projeta um feixe luminoso sobre o espécime. A objetiva recebe a luz que atravessou o espécime e projeta uma imagem aumentada do objeto em direção a ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta na retina, em uma tela, em uma câmera fotográfica ou em um detector eletrônico. No caso das imagens projetadas na retina, a ampliação total é calculada multiplicando-se o aumento da objetiva pelo aumento da ocular.

• Resolução Poder de resolução é definido como a menor distância entre duas partículas ou entre duas linhas a qual permite que elas sejam vistas como dois objetos separados. O poder de resolução máximo do microscópio de luz é de aproximadamente 0,2 um; esta resolução permite a obtenção de boas imagens aumentadas ate 1000 a

1500 vezes. Objetos menores que 0,2 um não podem ser distinguidos com este instrumento. Dois objetos serão vistos como um só objeto se eles estiverem separados por menos de 0,2 um. Aumentar só tem valor pratico se for acompanhado de resolução que depende essencialmente da objetiva, pois a lente ocular apenas aumenta a imagem nela projetada pela objetiva. Esta sendo ampliada o uso de vídeo-cameras de alta sensibilidade e resolução que permitem a digitalização de imagens que podem ser usadas em computadores para analisa quantitativa por meio de aplicativos de analise de imagens.

MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE CONTRASTE

DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA

Sistemas ópticos que permitem a observação de células e cortes não corados. Microscopia de contraste de fase usa um sistema de lentes que produz imagens visíveis de objetos quase transparentes.

A microscopia de contraste de fase é baseada no fato de que a luz muda sua velocidade ao atravessar estruturas celulares e extracelulares que tenham índices de refração diferentes. Estas mudanças são usadas pelo sistema de contrastes de fase para fazer com que as estruturas apareçam mais claras ou mais escuras e fazem deste tipo de microscopia uma ferramenta para observar células vivas. A microscopia de contraste diferencial produz uma imagem aparentemente tridimensional.

MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO

Quando raios de luz passam através de um filtro polarizador (como um Nicol ou um filtro Polaroid), eles saem vibrando em uma só direção. Um segundo filtro colocado com seu eixo principal perpendicular ao primeiro filtro bloqueará a passagem da luz. Se um tecido que tiver estruturas formadas por átomos e moléculas com um alto grau de orientação (como celulose, colágeno, cristais, microtúbulos e microfilamentos) for colocado entre os dois filtros, a estrutura molecular repetitiva e orientada modifica o plano de vibração da luz que emerge do primeiro filtro, fazendo com que estas

fluorescência. Na microscopia de fluorescência as secções de tecidos são irradiadas com luz ultravioleta e emitem luz na porção visível de espectro, fazendo com que as substancias fluorescentes apareçam brilhantes. O microscópio possui uma fonte de luz ultravioleta muito intensa e filtros especiais que selecionam o comprimento de onda dos raios luminosos que atingem o espécime e também dos raios que são emitidos pelo espécime. Substancias fluorescentes que tenham afinidade por moléculas presentes nas células ou na matriz extracelular podem ser usadas como corantes fluorescentes, como o alaranjado de acridina, que pode combinar com o DNA e o RNA. O complexo DNA-alaranjado de acridina emite fluorescência de cor verde-amarelada e o complexo RNA-alaranjado de acridina emite vermelha alaranjada. Outra aplicação resulta da combinação química de substancias fluorescentes (como isotiocianato de fluoresceina – FITC) com moléculas que se ligam especificamente a componentes das células e tecidos, permitindo a identificação destes componentes através da fluorescência que eles irão emitir.

MICROSCOPIA ELETRÔNICA

A microscopia eletrônica de transmissão e de varredura se baseia na interação entre elétrons e componentes dos tecidos.

• Microscopia eletrônica de transmissão É um sistema de produção de imagens que permite uma altíssima resolução (0,1 nm, na prática 3nm), resoluções que permite que espécimes ampliados a até 400000 vezes sejam vistos com detalhes. Esta ampliação só pode ser usada para analisar partículas ou moléculas isoladas, pois cortes delgados de células e tecidos podem ser observados com detalhes em aumento de ate cerca de 120000 vezes.

O funcionamento do microscópio se baseia em: elétrons podem ser desviados por campos eletromagnéticos de uma maneira semelhante ao desvio (refração) produzido na luz por lentes de vidro. Elétrons são liberados pelo aquecimento de um filamento metálico (catodo de tungstênio) em vácuo.Os elétrons liberados no catodo são submetidos a uma diferença de voltagem de 60-120 kV existente entre catodo e anodo. Os elétrons são atraídos pelo anodo e acelerados, atingindo altas velocidades. Após passarem pelo orifício do anodo eles formam um feixe de elétrons

que percorre o tubo do microscópio. No tubo, o feixe de elétrons passa pelo interior de bobinas elétricas (bobinas eletromagnéticas) e é desviado de maneira análoga ao que acontece com um feixe luminoso em lentes de vidro. A configuração do microscópio: a primeira lente é uma condensadora que focaliza o feixe de elétrons do espécime. Ao atravessar o corte alguns elétrons interagem com átomos do espécime e continuam seus trajetos em direção às outras lentes, enquanto outros elétrons simplesmente cruzam o corte e =sem interagir com ele. Dos elétrons que atingem a lente objetiva forma-se uma imagem aumentada do objeto que é projetada nas outras lentes que por sua vez aumentam a imagem ainda mais. Para se observar uma imagem os elétrons necessitam ser captados por um detector, uma placa fluorescente, um negativo fotográfico o uma câmera CCD. Como a imagem no microscópio é produzida pelo balanço da quantidade de elétrons que atingiram o detector e elétrons que foram retidos no tubo do microscópio, a imagem resultante é sempre em preto-e-branco. As áreas escuras de uma micrografia eletrônica costumam ser denominada de elétron-densas, e áreas claras de elétron-lucentes ou elétron- transparentes O microscópio utiliza cortes muito mais delgados. Para obter estes cortes os tecidos são incluídos em resinas plásticas, como as do tipo epóxi. Os blocos de tecido são seccionados com navalhas de vidro ou de diamante e os cortes são coletados sobre pequenas grades de metal.

• Microscopia eletrônica de varredura Fornece imagens pseudotridimensionais das superfícies de células, tecidos e órgãos. Neste microscópio um feixe de elétrons de diâmetro muito pequeno é focalizado sobre o espécime percorrendo seqüencialmente sua superfície. Os elétrons não atravessam o espécime. Os elétrons varrem uma delgada camada de metal previamente aplicada ao espécime e são capturados por um detector e transmitidos a amplificadores e outros componentes eletrônicos que geram um sinal. Este resulta em uma imagem preto-e-branco que pode ser observada em um monitor, gravada ou fotografada. Nas imagens os objetos parecem ser iluminados e possuem locais sombreados fornecendo uma idéia de três dimensões.

As células e os tecidos são cultivados em soluções de composição conhecida (sais, aminoácidos, vitaminas) às quais são freqüentemente adicionados componentes do soro. Para preparar devem ser inicialmente separadas mecanicamente ou por meio de tratamento enzimático. Uma vez isoladas as células podem ser cultivadas em suspensão ou podem ser colocadas sobre uma placa de Petri ou sobre uma lamínula de vidro, superfícies sobre as quais elas costumam aderir e crescer sob forma de uma única camada de células. Culturas feitas desta maneira são culturas primarias. A maioria das células obtidas de tecidos normais tem uma duração de vida finita, programada geneticamente. Muitos tipos de células originalmente isolados a partir de tecidos normais ou patológicos e mantidos in vitro constituem agora linhagem permanente de células. Para permitir a “imortalidade” de células normais in vitro há necessidade submetê-las a um processo chamado de transformação. Todos os procedimentos com células e tecidos vivos devem obviamente ser executados em uma área estéril e usando-se soluções e equipamentos estéreis.

FRACIONAMENTO CELULAR

Organelas e outros componentes das células e tecidos podem ser purificados e isolados por meio de uma técnica chamada fracionamento celular. É um processo físico pelo qual é usada a força centrifuga para separar as organelas e componentes celulares em função de seus coeficientes de sedimentação que depende de seu tamanho, forma, densidade e viscosidade do meio em que esta suspensa. A composição química e funções das organelas e moléculas podem então ser estudadas in vitro. As frações obtidas por estas técnicas podem ser analisadas ao microscópio eletrônico para verificar sua pureza.

HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA

Estes termos são usados para indicar métodos que identificam e localizam substancias em cortes histológicos ou em células cultivadas. Há vários procedimentos para obter estas informações, a maioria baseada em reações químicas especificas ou em interações de alta afinidade entre moléculas. Estes métodos normalmente originam substancias insolúveis coloridas ou elétron-densas, que permitem a localização de átomos ou de moléculas por microscopia de luz ou eletrônica.

• Íons Vários íons podem ser localizados em tecidos com estes métodos, usando reações químicas que produzem produtos insolúveis escuros ou coloridos.
• Ácidos nucléicos O DNA pode ser identificado e quantificado nos núcleos das células por meio de reação de Feugen, que produz uma cor vermelha no DNA. O DNA e o RNA também podem ser evidenciados pela coloração de células ou de cortes de tecidos com corantes básicos.
• Proteínas Embora haja métodos gerais para detectar proteínas e, células e cortes de tecidos, os métodos histoquímicos normalmente não permitem localização de proteínas específicas, o que pode ser feito pela imunocitoquímica

Há, porém, vários métodos histoquímicos que revelam com maior ou menor especificidade um grupo grande de proteínas, as enzimas. Estes métodos normalmente aproveitam a capacidades das enzimas para reagir com ligações químicas especificas. A maioria dos métodos histoenzimáticos funciona do seguinte modo:

1. cortes de tecidos são imersos em uma solução que contem o substrato da enzima cuja presença se quer verificar, e desta maneira se permite enzimas se apresenta nas células ou matriz interaja com o seu substratos ;

2. Em seguida o corte é posto em contato com a substância marcadora que reage com uma molécula que deve ser insolúvel, precipita sobre o local que contém a enzima, denunciando-a; este produto final deve ser colorido ou elétron-denso para ser visível por microcospia de luz ou eletrônica. Ao examinar um destes cortes ao microscópico, é possível observar as células (ou organelas) cobertas com um material colorido ou elétron-denso.

Alguns exemplos de enzimas que podem ser detectadas são:

• Fosfatases são enzimas amplamente encontradas no organismo.Elas clivam a ligação entre um grupo fosfato e um resíduo de álcool de moléculas fosforiladas. O produto estas técnicas podem-se detectar fosfatases alcalinas que têm sua atividade máxima em um pH

Os Polissacarídeos do nosso organismo existem livres ou combinados com proteínas e lipídios. Quando combinados eles constituem um grupo heterogêneo e extremamente complexo. Eles podem ser demonstrados pela reação de ácido período- Schiff (PAS), que se baseia na transformação de radicais 1,2-glicol presentes nos açucares em resíduos de aldeído. Estes resíduos são, em seguida, revelados pelo reagente de Schiff, que produz uma coloração púrpura ou magenta nos locais do corte em que há muitos polissacarídeos. Um polissacarídeo livre muito encontrado no organismo é o glicogênio, que pode ser demonstrado pela reação de PAS em fígado, músculo estriado e outros tecidos onde se acumula.

Glicoproteínas são moléculas de proteinas associadas com cadeias pequenas e ramificadas de açucares (oligossacarídeos). A cadeia protéica predomina em peso e volume sobre cadeia oligossacarídeos. Enquanto algumas glicoproteínas não contêm nenhum grupo ácido (glicoproteínas neutras ) e são PAS-possitivas , outras possuem radicais carboxila ou sulfato.Com tanto o glicogênio como as glicoproteínas neutras são PAS-possitivos, a especificidade da reação de PAS pode ser melhorada comparando a coloração de cortes submetidos a esta técnica com outros que foram pré- tratados com uma enzima que digere glicogênio.(por exemplo, amilase salivar ). Estruturas que se coram intensamente por PAS mas, que perdem estar capacidade quando pré-tratadas com amilase contêm glicogênio.

Glicosaminoglicanos são polissacarídeos não ramificados, fortemente aniônico, que contêm monossacaríodeos aminados (aminoaçúcares). Quando um grande número de cadeias de glicosaminoglicanos se prende ao longo de um eixo protético elas constituem os proteoglicanos.Alguns dos componentes mais importante da matriz extracelular do tecido conjuntivo são proteoglicanos. Diferentemente das glicoproteínas, nos proteoglicanos as cadeias de carboidrato constituem o componente principal da molécula. Glicosaminoglicanos e glicoproteinas ácidas são fortemente aniônicas por causa do seu alto conteúdo de grupos carboxila e de sulfato. Por esta razão, eles reagem intensamente com corante Alcian blue

• Lipídios A melhor maneira de revelar os lipídios é por meio de corantes que são imersos em solução alcoólicas saturadas com esses corantes ( os corantes Suda IV e

Sudan Black são os mais usados ).O corante de dissolve na gotículas de lipídios, as quais adquirem a cor do corante.Métodos adicionais usados para localização de colesterol e seus ésteres, de fosfolipídios e de glicolipídios são úteis para diagnostica doenças metabólicas em que há acúmulo intracelular de diferentes tipos de lipídios.

DETECÇÃO DE MOLÉCULAS EM CORTES HISTOLÓGICOS POR MEIO DE

INTERAÇÃO MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE

Uma molécula presente em uma célula ou em um corte de tecido pode ser percebida por meio de compostos que interagem especificamente e ligam-se com a moléculas que queremos detectar.Os compostos capazes de fazer o reconhecimento devem ser previamente acoplados a um marcador, para que o conjunto molécula- compostomarcador possa ser visto por meio de um microscópico de luz ou eletrônico.Os marcadores mais usados são: substancia florescentes ( param serem visualizados como um microscópico de florescência ou de laser ), átomos radioativos (para serem detectados por radiofotografia), moléculas de enzimas como a peroxidase que pode ser detectadas pela demonstração da enzima com peróxido de hidrogênio e DAB, metais (geralmente partículas de ouro) que podem ser observados por microscopia de luz e eletrônica.Estes métodos se destinam principalmente para detectar açucares, proteínas e ácido nucléicos.

Faloidina, proteína A lectinas e anticorpos são exemplos de compostos que interagem especificamente com outras moléculas.

A Faloidina que é extraída de um cogumelo (Amanita phalloides ), interage fortemente com actina e é geralmente marcada com substancias fluorescentes para demonstrar filamentos de actina.

A proteína A é uma proteína extraída Staphylococcus aureus que se liga à região Fc de moléculas imunoglobulinas (anticorpos). Quando a proteína A é ligada a um marcador, podemos detectar imunoglobulinas com grande precisão.

As lectinas são proteínas ou glicoproteínas derivadas principalmente de sementes de vegetais que se ligam com alta afinidade e especificidade a carboidratos.Diferentes lectinas interagem com diferente açucares ou seqüências de açucares.Elas , portanto,se ligam a glicoproteínas, proteoglicanos e glicolipídios e são