Métodos de Diagnóstico de Doenças Virais: HIV e Hepatites | Esquemas Imunologia

Atividade Avaliativa

Imunologia Clínica – Profa. Me. Andiara Wrzesinski

Discente: Gabriela Nunes dos Santos Data: 13/04/2020

A metodologia empregada para a realização do diagnóstico de doenças

causadas por vírus

HIV - Os testes para detecção da infecção pelo HIV são principalmente empregados em três

situações: para triagem sorológica do sangue doado e garantia da segurança transfusional, dos

hemoderivados e dos órgãos para transplante; para os estudos de vigilância epidemiológica; e para

realizar o diagnóstico da infecção pelo HIV. A seguir, estão descritos os testes mais comumente

utilizados no diagnóstico da infecção pelo HIV.

1. Imunoensaio: Logo após a descoberta do HIV, foram desenvolvidos imunoensaios (IE) para

o diagnóstico da infecção. Nas últimas décadas, sucederam-se quatro gerações de IE. Essas

gerações foram definidas de acordo com a evolução das metodologias empregadas, a partir do

primeiro ensaio disponível comercialmente, no ano de 1985. As principais características das quatro

gerações de IE estão descritas a seguir.

a) Primeira geração: O ensaio de primeira geração tem o formato indireto, ou seja, a presença

de anticorpos específicos é detectada por um conjugado constituído por um anticorpo anti-IgG

humana. Na fase sólida, os antígenos são originados de um lisado viral de HIV. Os antígenos do

lisado viral são conseguidos a partir de cultura do HIV em linhagens celulares humanas. O vírus é

obtido do sobrenadante da cultura, concentrado por centrifugação e lisado para expor as proteínas

virais. Essas proteínas são posteriormente purificadas; entretanto, as diferentes proteínas virais não

são obtidas com a mesma eficiência e algumas sofrem degradação, alterando as proporções

estequiométricas das proteínas presentes no vírion. Além disso, proteínas de origem celular e outras

impurezas, provenientes do meio de cultura, também podem estar presentes na preparação

antigênica final. Dessa forma, o “caldo” constituído por proteínas virais (em proporções distintas

daquelas encontradas no vírion), proteínas de células humanas e do meio de cultura, são utilizadas

como antígenos na fase sólida do ensaio de primeira geração. Essas características tornam os

ensaios de primeira geração pouco específicos e, pelo fato de detectarem apenas IgG, também são

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Atividade Avaliativa Imunologia Clínica – Profa. Me. Andiara Wrzesinski Discente: Gabriela Nunes dos Santos Data: 13/04/

A metodologia empregada para a realização do diagnóstico de doenças

causadas por vírus

 HIV - Os testes para detecção da infecção pelo HIV são principalmente empregados em três situações: para triagem sorológica do sangue doado e garantia da segurança transfusional, dos hemoderivados e dos órgãos para transplante; para os estudos de vigilância epidemiológica; e para realizar o diagnóstico da infecção pelo HIV. A seguir, estão descritos os testes mais comumente utilizados no diagnóstico da infecção pelo HIV.

Imunoensaio : Logo após a descoberta do HIV, foram desenvolvidos imunoensaios (IE) para o diagnóstico da infecção. Nas últimas décadas, sucederam-se quatro gerações de IE. Essas gerações foram definidas de acordo com a evolução das metodologias empregadas, a partir do primeiro ensaio disponível comercialmente, no ano de 1985. As principais características das quatro gerações de IE estão descritas a seguir. a) Primeira geração : O ensaio de primeira geração tem o formato indireto, ou seja, a presença de anticorpos específicos é detectada por um conjugado constituído por um anticorpo anti-IgG humana. Na fase sólida, os antígenos são originados de um lisado viral de HIV. Os antígenos do lisado viral são conseguidos a partir de cultura do HIV em linhagens celulares humanas. O vírus é obtido do sobrenadante da cultura, concentrado por centrifugação e lisado para expor as proteínas virais. Essas proteínas são posteriormente purificadas; entretanto, as diferentes proteínas virais não são obtidas com a mesma eficiência e algumas sofrem degradação, alterando as proporções estequiométricas das proteínas presentes no vírion. Além disso, proteínas de origem celular e outras impurezas, provenientes do meio de cultura, também podem estar presentes na preparação antigênica final. Dessa forma, o “caldo” constituído por proteínas virais (em proporções distintas daquelas encontradas no vírion), proteínas de células humanas e do meio de cultura, são utilizadas como antígenos na fase sólida do ensaio de primeira geração. Essas características tornam os ensaios de primeira geração pouco específicos e, pelo fato de detectarem apenas IgG, também são

menos sensíveis do que os ensaios de gerações posteriores. Em média, a janela de soro conversão dos ensaios de primeira geração é de 35 a 45 dias. Atualmente, esses ensaios deixaram de ser utilizados na rotina diagnóstica dos laboratórios. b) Segunda geração : O ensaio de segunda geração também tem formato indireto; porém, utiliza antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos derivados de proteínas do HIV. A utilização de antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos no diagnóstico da infecção pelo HIV decorre do conhecimento de que existem regiões antigênicas em determinadas proteínas do HIV – epítopos imunodominantes – que são alvos preferenciais da resposta imune humoral. Quanto maior a quantidade de epítopos imunodominantes no ensaio, mais sensível esse ensaio se torna. Proteínas fracamente imunodominantes, ou aquelas em que o aparecimento do anticorpo se dá mais tardiamente, não contribuem para melhorar o desempenho do ensaio e ainda podem ser fonte de reatividade inespecífica. Em comparação com os ensaios de primeira geração, os de segunda geração são mais sensíveis e específicos, por conterem uma maior concentração de epítopos imunodominantes relevantes. Em média, a janela de soroconversão dos ensaios de segunda geração é de 25 a 35 dias. c) Terceira geração : O ensaio de terceira geração tem o formato “sanduíche” (ou imunométrico). A característica desse ensaio é utilizar antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos tanto na fase sólida quanto sob a forma de conjugado. Esse formato permite a detecção simultânea de anticorpos anti-HIV IgM e IgG. Como a IgG é bivalente, ou seja, possui dois sítios de ligação ao antígeno (chamados de região Fab da imunoglobulina) e a IgM é pentavalente, um desses sítios liga-se ao antígeno adsorvido à fase sólida e os outros Fab ficam livres para posteriormente ligarem-se aos mesmos antígenos solúveis, sob a forma de conjugado. Dessa forma, o anticorpo fica “entre” dois antígenos e, por essa característica, qualquer classe de imunoglobulina anti-HIV (IgG, IgM, IgA ou IgE) será detectada por esse tipo de metodologia. A possibilidade de detectar anticorpos da classe IgM torna esse ensaio mais sensível do que os de gerações anteriores. d) Quarta geração : Este ensaio detecta simultaneamente o antígeno p24 e anticorpos específicos anti-HIV. O componente de detecção de anticorpo tem o formato de “sanduíche”; portanto, detectam todas as classes de imunoglobulinas contra proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos derivados das glicoproteínas gp41 e gp120/160. O componente de detecção de antígeno p24 é constituído por um anticorpo monoclonal na fase sólida (para capturar o antígeno p presente no soro) e de um conjugado constituído por um antissoro (anticorpo) poliespecífico contra a proteína p24, ou mesmo outro anticorpo monoclonal contra um segundo epítopo da proteína p24. Em média, a janela diagnóstica dos ensaios de quarta geração é de aproximadamente 15 dias, dependendo do ensaio utilizado.

a) Ensaios imunoenzimáticos Incluem os ensaios do tipo ELISA (do inglês enzyme-linked immunosorbent assay) e ELFA (do inglês enzyme-linked $uorescent assay), sendo utilizados no diagnóstico das infecções virais por meio da detecção de antígenos e/ou anticorpos específicos contra o patógeno, isoladamente ou de forma combinada. Em um teste ELISA, para a detecção de anticorpos, um antígeno é imobilizado em uma superfície sólida. O anticorpo presente na amostra do paciente se liga ao antígeno, ficando preso na superfície sólida. Acrescenta-se ao sistema um conjugado (anticorpo ligado a uma enzima), que irá se ligar ao anticorpo preso ao antígeno. A detecção ocorre por meio da incubação desse complexo enzimático (antígeno + anticorpo + anticorpo- -enzima) com um substrato que, ao ser consumido pela enzima, resultará em um produto detectável (colorido ou insolúvel). O principal elemento para a estratégia de detecção é uma interação antígeno-anticorpo altamente específica. O teste ELFA segue o mesmo princípio do ELISA, com a diferença de utilizar um substrato que gera um sinal fluorescente, ao invés de colorido ou insolúvel. A fluorescência pode ser detectada em concentrações menores que as de produtos coloridos, o que garante maior sensibilidade clínica ao teste. b) Ensaios luminescentes : A quimioluminescência e a eletroquimioluminescência são tipos de luminescência nos quais o evento excitatório é provocado por uma reação química ou eletroquímica, respectivamente. O evento físico de emissão de luz na quimioluminescência e na eletroquimioluminescência é semelhante ao da fluorescência. A emissão de luz ocorre a partir de um elétron em estado excitado que retorna ao seu estado fundamental, emitindo um fóton. A vantagem desse processo consiste na simplicidade de preparação, na alta estabilidade dos reagentes e em uma grande sensibilidade. c) Testes rápidos (TR): constituem imunoensaios cromatográficos de execução simples, que podem ser realizados em até 30 minutos e que não necessitam de estrutura laboratorial. Os TR são fundamentais para a ampliação do acesso ao diagnóstico e aumentam a resolutividade do sistema. A ampliação do diagnóstico por meio do uso de TR permite a detecção precoce dos vírus causadores das hepatites B e C, possibilitando a rápida vinculação do paciente aos serviços de assistência para a conclusão do diagnóstico. Os testes rápidos utilizados para o diagnóstico das hepatites B e C baseiam-se na tecnologia de imunocromatografia de fluxo lateral. O teste para hepatite B permite a detecção do antígeno de superfície do HBV (HBsAg) no soro, plasma ou sangue total. Para a hepatite C, o teste detecta o anticorpo anti-HCV no soro, plasma, sangue total ou fluido oral.

Teste molecular - A reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction) é uma das técnicas mais utilizadas no diagnóstico molecular laboratorial. Por meio dessa técnica, é possível amplificar uma região de interesse em uma molécula de DNA utilizando um par de sequências curtas de nucleotídeos (oligonucleotídeos iniciadores) que se localizam nos flancos dessa região, em conjunto com uma enzima DNA polimerase termorresistente. Dessa forma,

podem-se produzir múltiplas cópias dessa região de interesse. A reação acontece em ciclos, marcados por variações de temperatura que determinam os eventos da reação: desnaturação, anelamento e polimerização. Na desnaturação, a alta temperatura (entre 90°C e 95°C) separa as +tas complementares da molécula de DNA alvo. O anelamento ocorre a uma temperatura menor (por volta de 55°C) e, nessa essa fase, os oligonucleotídeos iniciadores se ligam às suas regiões complementares nas fitas de DNA alvo. Finalmente, na polimerização (que acontece a 75°C), a DNA polimerase executa a leitura das fitas de DNA alvo e ocorre a consequente polimerização de novas +tas a partir do molde. Cada ciclo será repetido de 40 a 50 vezes e durante cada repetição a quantidade de cópias da região alvo irá ser duplicada. A partir daí, o material amplificado poderá ser visualizado por meio de diversas técnicas, como eletroforese em géis de agarose.  RUBÉOLA – Diagnóstico clínico, laboratorial e epidemiológico. Leucopenia é um achado frequente. O diagnóstico sorológico pode ser realizado através da detecção de anticorpos IgM específicos para Rubéola, desde o início até o 28º dia após o exantema. A sua presença indica infecção recente. A detecção de anticorpos IgG ocorre, geralmente, após o desaparecimento do exantema, alcançando pico máximo entre 10 e 20 dias, permanecendo detectáveis por toda a vida. São utilizadas as seguintes técnicas: inibição da hemaglutinação, que apesar do baixo custo e simples execução, seu uso vem sendo substituído por outras técnicas mais sensíveis, como aglutinação do látex, imunofluorescência, hemaglutinação passiva, ensaio imunoenzimático (ELISA). Os laboratórios de referência para o diagnóstico da Rubéola, realizam de rotina, somente a pesquisa de anticorpos IgM, pelo método ELISA, no caso de Rubéola pós natal. A conduta para gestantes é diferenciada.

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A metodologia empregada para a realização do diagnóstico de doenças

causadas por vírus