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RELATÓRIO REFERENTE AO DIA 02_09
Tipologia: Exercícios
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Ponto isoelétrico Ponto isoelétrico é quando há equivalência de cargas, ou seja, o número de cargas positivas e negativas se igualam, causando a neutralidade.Quando a amostra chega no PI significa que ela precipitou, ou seja, ocorre a diminuição da solubilidade da amostra, pois o soluto vai interagir mais com o soluto e menos com o solvente, ocasionando a diminuição da solubilidade. O ponto isoelétrico nem sempre é visível, pois a amostra pode ser menos concentrada, ou seja, possuir pouco soluto. Com isso, é possível descobrir o ponto isoelétrico de uma amostra a partir da verificação de seu pH, porém a forma mais precisa de determinar o PI de uma proteína é realizando a técnica de titulação. O pH característico no qual a carga elétrica final é zero é chamado de ponto isoelétrico ou pH isoelétrico, designado por pI (NELSON & COX, 2014). Proteínas As proteínas são polímeros de aminoácidos unidos por ligações, denominadas ligações peptídicas, uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH 2 ) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma amida. Além disso, os diferentes grupamentos "R" encontrados nos aminoácidos influenciam na estrutura, na funcionalidade e nas propriedades das proteínas individuais.A maioria das proteínas encontradas nos seres vivos é formada por L-aminoácidos. Os D-aminoácidos aparecem somente em certos antibióticos peptídicos e em peptídeos componentes da parede de algumas bactérias. Apesar de muitas proteínas conterem outras substâncias, além dos aminoácidos, a estrutura tridimensional e muitas das propriedades biológicas das proteínas são determinadas, em grande parte, pelos tipos de aminoácidos presentes em sua molécula, a ordem em que eles estão unidos entre si, na formação da cadeia polipeptídica e, ainda, pela inter-relação espacial de um aminoácido com o outro. Em soluções aquosas de pH neutro, os aminoácidos podem existir em duas formas. Uma pequena fração pode encontrar numa forma electricamente neutra, ou seja, com o grupo amina desprotonado (-NH2) e o grupo carboxila protonado (-COOH). A maioria estará, no entanto, numa forma ionizada, em que o grupo amina se encontra protonado (-NH3+) e o ácido carboxílico desprotonado a carboxilato (-COO-),denominando-se esta forma de zwitteriônica (do alemão zwitter, que significa "híbrido"). Um zwitteríon é uma molécula globalmente neutra em termos de carga elétrica, mas possui cargas locais devido à presença de grupos ionizados (NELSON & COX, 2002). A perda das estruturas secundária e terciária da proteína ou rompimento de ligações peptídicas é denominada desnaturação da proteína. Alguns fatores que provocam a desnaturação são o calor, radiações eletromagnéticas de certos comprimentos de onda, ácidos e bases, solventes orgânicos e íons de metais pesados (CAMPBELL, 2001). Estrutura Primária A estrutura primária é caracterizada pela sequência única de aminoácidos em uma cadeia polipeptídica (Site Openstax, 2018). Embora a sequência de aminoácidos em algumas regiões da estrutura primária possa variar consideravelmente sem afetar a função biológica, a maior parte das proteínas contém regiões
alimentos, favorecendo o entendimento dos vários aspectos da vida dos animais silvestres; e na área de química de proteínas objetivando purificar novas proteínas e enzimas (ZAIA, ZAIA & LICHTIG, 1998). Caseína A caseína que é uma proteína do tipo fosfoproteína encontrada no leite fresco, que quando coagulada com renina é chamada de "paracaseína" e, quando coagulada através da redução de pH é chamada "caseína ácida”, apresenta ponto isoelétrico 4,6 que é o ponto de pH em que ela precipita (coagulação ácida). A caseína precipita no ponto isoelétrico, porque existe um equilíbrio entre o número de cargas positivas e negativas, o que gera uma situação em que as forças de repulsão entre as moléculas de proteína e as forças de interação com o solvente são mínimas. Assim, as proteínas vão formando aglomerados que, cada vez maiores, tendem a precipitação. Essa diminuição de solubilidade varia de proteína para proteína. (SILVA, JAILSON; EVANNS, JOYCE; WEDDIJA, MAYRA & JUNIOR, WELENILTON, 2013) Desnaturação e agentes desnaturantes As proteínas têm uma existência surpreendentemente precária. A conformação de uma proteína nativa é apenas marginalmente estável. Além disso, a maioria das proteínas deve manter certa flexibilidade conformacional para funcionar. A estabilidade marginal da maioria das proteínas pode produzir um balanço tênue entre os estados dobrados e desdobrados. A perda de estrutura tridimensional suficiente para causar a perda de função é chamada de “desnaturação”. O estado desnaturado não necessariamente corresponde ao desdobramento completo da proteína e à randomização da conformação. Na maioria das condições, as proteínas desnaturadas existem como um conjunto de estados parcialmente dobrados (LEHNINGER, 2014). A desnaturação frequentemente leva à precipitação de proteínas, uma consequência da formação de agregados proteicos pela exposição de superfícies hidrofóbicas associadas. Os agregados são, com frequência, altamente desordenados. O precipitado proteico visto após ferver um ovo é um exemplo. Agregados mais ordenados também são observados em algumas proteínas (LEHNINGER, 2014). Existem algumas maneiras de se alterar a solubilidade das proteínas: Calor (+80ºc no banho-maria) A maioria das proteínas pode ser desnaturada pelo calor, que tem efeitos complexos nas muitas interações fracas da proteína (principalmente sobre as ligações de hidrogênio). Se a temperatura é aumentada lentamente, a conformação da proteína em geral permanece intacta até que, em uma estreita faixa de temperatura, ocorre uma perda abrupta da estrutura (e da função). A mudança repentina sugere que o desdobramento é um processo cooperativo: a perda de estrutura em uma parte da proteína desestabiliza as outras partes (LEHNINGER, 2014). S oluções salinas por efeito salting-out (eleva-se a força iônica da solução e a solubilidade reduz gradualmente). Com a junção de metais pesados, a precipitação ocorre pela junção de cátion metálico com cargas negativas da proteína. As proteínas também podem precipitar pela inserção de ácido nítrico, através da desidratação decorrente do ânion nitrato e a prolongação dos restos de Asp. e Gul. (-COO-^ + H+^ = -COOH), assim rompendo as ligações eletrostáticas (SKOOG, 2005).
Ácidos Fortes (Ácido Tricloroacético) é um tratamento relativamente brando, já que nenhuma ligação covalente da cadeia polipeptídica é rompida. Extremos de pH alteram a carga líquida da proteína, causando repulsão eletrostática e o rompimento de algumas ligações de hidrogênio (LEHNINGER, 2014). Os metais pesados (Pb, Hg, Ag, Cu) causam a desnaturação de proteínas modificando a sua conformação natural com a atividade biológica, para uma conformação não natural biologicamente inativa (desnaturada). As moléculas proteicas desnaturadas precipitam porque o chumbo é insolúvel em água (OLIVEIRA, 2010). OBJETIVOS PRÁTICA 1: EXTRAÇÃO E PONTO ISOELÉTRICO DA CASEÍNA ● Reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas; ● Analisar a influência do pH sobre a distribuição dessas cargas. PRÁTICA 2: REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DAS PROTEÍNAS ● Caracterizar a presença de proteínas em material biológico; ● Demonstrar as reações de coloração para proteínas; ● Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação; ● Relacionar as observações práticas com a teoria de proteínas gerais, estrutura e isolamento de proteínas. MATERIAIS E MÉTODOS PRÁTICA 1: EXTRAÇÃO E PONTO ISOELÉTRICO DA CASEÍNA ● MATERIAIS ○ Chapa de agitação magnética ○ Béquer de vidro de 1000mL para o Banho Maria ○ Erlenmeyer 250mL ○ Pipeta ○ Termômetro ○ Bastão de vidro ○ Funil ○ Papel de filtro ○ Reativos ■ Ácido acético glacial ■ Leite ■ Éter ■ Ácido acético 0,1 mol/L ■ Acetato de sódio 0,1 M ● MÉTODOS ○ Isolamento de caseína Em um erlenmeyer de 250mL adicione 50 g de leite. Mergulhe o erlenmeyer em um banho maria com cerca de 200mL de água. Agite a solução constantemente com um bastão de vidro. Quando a temperatura atingir 40°C remova o banho e adicione 10
■ Álcool etílico absoluto ■ Clara de ovo "in natura" ■ Cloreto de sódio 1 mol/L ■ Solução saturada de sulfato de amônio 76,6 g% p/v ● MÉTODOS ○ Preparo dos Reativos ■ Solução de proteínas: preparar uma solução de clara de ovo a 10% v/v em solução salina (NaCl 0,9g/100mL) ou tampão fosfato 10 mmol/L, pH 7,0. ■ Solução de ninhidrina: pesar 100 mg de ninhidrina e dissolver em 100 mL de tampão fosfato 0,01 mol/L, pH 7,0. Conservar em frasco escuro e em geladeira. ○ Reações de coloração ■ a) Reação da Ninhidrina: Tubo 1: 2 mL de ninhidrina + 5 gotas de proteínas 10%, banho-maria por 5 min. a 100°C. Anotar o resultado. ■ b) Reação do Biureto: Tubo 2: 1 mL de proteína 10% + [5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre 1%] = reagente Biureto. Anotar o resultado. Tubo 3: 1 mL de água destilada + [5 gotas de NaOH 2,5 mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre 1%] = reagente Biureto. Anotar o resultado. ○ Reações de precipitação ■ a) Ação do calor - Tubo 4: 1 mL de proteína 10%, aquecendo em banho-maria a 100ºC por 3 min. Anotar o resultado. ■ b) Reação com reagentes para alcalóides (ácido forte) - Tubo 5: 1 mL de proteína 10% + 1 mL de TCA (Ácido tricloroacético) 10%. Anotar o resultado. ■ c) Reação com sais de metais pesados - Tubo 6: 1 mL de proteína 10% + 1 mL de acetato de chumbo 5%. Anotar o resultado. ■ d) Reação com solventes orgânicos - Tubo 7: 1 mL de proteína 10% + 1 mL de álcool etílico. Anotar o resultado. ○ Efeito da adição de sais ( salting-in e salting-out ) ■ Tubo 8: 15 mL de clara de ovo pura + água destilada até a formação de precipitado esbranquiçado (precipitado de proteína). Dissolver com auxílio de um bastão,e pegar 3 mL da solução anterior e adicionar NaCl 1mol/L gota a gota até o precipitado redissolver. Anotar o resultado. ■ Tubo 9: Na solução anterior + 4 mL de solução sulfato de amônio. Observar o precipitado ( Salting-out ). Anotar o resultado.
Quadro 1. Tabela referente ao experimento da determinação do ponto isoelétrico da proteína caseína. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 pH 4,0 4,3 4,7 4,9 5,2 5,6 6, CH 3 COOH 0,1 mol/L
CH 3 COOHNa 0,1 mol/L
Quadro 2. Tabela referente a turbidez em cada tubo do ponto isoelétrico da proteína caseína. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 pH calculado
Turbidez (0 a 5)
Imagem 1: Tubos após a decantação. Tubo 1: Foi possível observar a precipitação, mas a diferença de fases foi menor. Tubo 2: Foi possível observar a precipitação, mas a diferença de fases foi um pouco maior que a anterior. Tubo 3: Foi o tubo em que a visualização da precipitação foi mais significante, pois nele a concentração do agente desnaturante foi igualmente a concentração de caseína. Foi possível observar a precipitação, mas a diferença de fases foi menor.
O ponto isoelétrico da literatura foi um pouco diferente da amostra. A caseína que foi utilizada para a amostra possui um ponto isoelétrico diferente, pois o ponto isoelétrico da proteína isolada de caseína é 6,6 e o valor inferido foi o pH 4,7. Outro fator que pode influenciar é a preparação das amostras. Mesmo que não tenha sido observado nenhum erro durante o processo, uma das possibilidades é que tenha ocorrido alta acidificação da amostra, o que influencia nos resultados de pH e o tempo de decantação. ● PRÁTICA 2: REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DAS PROTEÍNAS ○ Reações de coloração ■ a) Reação da Ninhidrina: Imagem 3: Tubo 1 (ninhidrina mais proteínas 10% em banho-maria por 5 min. a 100°C). Esta reação é utilizada para verificar a presença de aminas em solução, dando positivo para proteínas, peptídeos, aminoácidos, aminas primárias e amônia. É realizada colocando no tubo 2mL de ninhidrina mais 5 gotas de proteínas 10% colocando em banho-maria por 5 min. a 100°C. Assim que passado o tempo de aquecimento é possível ver a mudança de cor para púrpura(positivo para proteínas). ■ b) Reação do Biureto: Imagem 4: Tubo 2 (proteína 10% mais 5 gotas de NaOH mais 3 gotas de CuSO4) a esquerda; Tubo 3 (água destilada mais 5 gotas de NaOH mais 3 gotas de CuSO4) a direita.
Esta reação é utilizada para verificar a presença de peptídeos com 3 ou mais resíduos de aminoácidos. As proteínas ou peptídeos, quando tratados por uma solução diluída de sulfato de cobre em meio alcalino, apresentam uma coloração púrpura característica. No tubo 2 é colocado 1 mL de proteína 10% mais 5 gotas de NaOH 2,5mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre 1%, resultando em uma coloração lilás (positivo para peptídeos). Já no Tubo 3 é colocado 1 mL de água destilada mais 5 gotas de NaOH 2,5mol/L e 3 gotas de sulfato de cobre 1%, resultando em uma coloração azulada (negativo para peptídeos). ○ Reações de precipitação ■ a) Ação do calor: Imagem 5: Tubo 4 (proteína 10% aquecida em banho-maria a 100ºC por 3 min.). Este procedimento é realizado para verificar o efeito do aquecimento (desnaturação) sobre a estrutura tridimensional da proteína e sua solubilidade em água. No tubo 4 foi colocado 1 mL de proteína 10% aquecendo em banho-maria a 100ºC por 3 min. Resultando em uma solução opaca. ■ b) Reação com reagentes para alcalóides (ácido forte): Imagem 6: Tubo 5 (proteína 10% mais TCA (Ácido tricloroacético) 10%).
○ Efeito da adição de sais ( salting-in e salting-out ) Imagem 9: Tubo 8 (clara de ovo pura mais água destilada até a formação de precipitado esbranquiçado mais NaCl ( salting-in )). O efeito “salting in” é o aumento da solubilidade de proteínas devido ao acréscimo de baixas concentrações de sais em solução. Os íons salinos interagem com as cargas iônicas das proteínas aumentando assim o número efetivo de cargas e a quantidade de moléculas de água fixadas à ionosfera proteica. Imagem 10: Tubo 9 (solução anterior mais solução sulfato de amônio ( Salting-out )). O efeito “salting out” é a precipitação de proteína em solução por altas concentrações de sais. Os sais atraem as moléculas de água do meio, de modo a ficar menos água disponível para as moléculas protéicas, o que acarreta na diminuição da solubilidade e precipitação. Foi observado durante o experimento, quando ocorreu a precipitação de proteínas que a principal propriedade observada foi: a solubilidade. A diminuição de solubilidade em algumas amostras, é explicada pela exposição de radicais apolares (hidrofóbicos) e outros, os quais prejudicam a interação proteína-solvente e favorecem a interação proteína-proteína, formando um precipitado. Além da solubilidade, alterações como a
viscosidade da solução foram observadas nas amostras, assim como em algumas também houve a alteração de coloração. O sal utilizado, sulfato de amônio (NH 4 )²SO 4 , devido a sua propriedade em baixa concentração pode aumentar a solubilidade de muitas proteínas (solubilização por salificação), isso porque a interação da proteína com o sal causa a diminuição da interação proteína-proteína. Já em concentrações elevadas, a solubilidade da proteína se reduz gradativamente (precipitação por salificação), isso porque acredita-se que a concentração elevada de sal pode remover água de hidratação das moléculas protéicas, levando a um aumento na interação proteína-proteína, ocorrendo precipitação. Após a adição do sal nós utilizamos a centrífuga para acelerar o processo de precipitação, porém, se esperássemos por muito tempo conseguiríamos observar a mudança do conteúdo do tubo do mesmo jeito. A precipitação por metal pesado foi utilizado o acetato de chumbo (CH3COO)2Pb, a adição de sais de metais pesados, tais como mercúrio, chumbo, cobre, zinco levam a formação de sais denominados “quelatos’’ entre os aminoácidos ácidos e estes metais. As proteínas precipitam porque estes sais são insolúveis em água e também porque, com a quebra das ligações iônicas, os aminoácidos hidrofóbicos ficam mais expostos ao meio aquoso. Os metais pesados (Pb, Hg, Ag, Cu) causam a desnaturação de proteínas, isto é, modificam a sua conformação natural com a atividade biológica, para uma conformação não natural, biologicamente inativa (desnaturada). As moléculas protéicas desnaturadas precipitam porque o chumbo é insolúvel em água. Os metais pesados precipitam as proteínas por desnaturação. O ácido forte utilizado no experimento “precipitação de proteínas” foi o ácido tricloroacético 10%. Quando a proteína está com pH abaixo do ponto isoelétrico, as bases provenientes de ácidos fortes são exemplos de íons negativos que combinam-se com partes positivas de proteínas, formando complexos insolúveis, que precipitam na solução. Como exemplos dessas bases podemos citar os alcalóides, uma classe de compostos naturais, e as bases derivadas do ácido tricloroacético (TCA). Esses reagentes também têm ação desnaturante, ou seja, provocam a perda da conformação tridimensional da proteína de forma irreversível. Consequentemente, a proteína separada por esse método perde a sua função. Precipitação por ação de calor, o calor fornecido a proteína provoca desestabilização das interações fracas (pontes de hidrogênio, interações dipolo-dipolo, interações de Van der Waals, etc.) acarretando em um desarranjo da conformação tridimensional desta estrutura. Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação e altera as estruturas secundária, terciária e quaternária das proteínas, não afetando suas estruturas primárias (pontes dissulfeto e ligações covalentes não são afetadas). A desnaturação promove alterações na solubilidade da proteína, levando à sua precipitação. Com o aquecimento da solução de proteínas, verificou-se precipitação.
diretamente ou através de um único á tomo de carbono ou nitrogênio. Esta é uma reação geral para proteínas. Esse fenômeno deve -se à formação de um complexo entre o íon Cu 2+, presente no reativo, e o s átomos de nitrogênio presentes na molécula ● 3. Qual a importância da reação do Biureto? R: A reação do Biureto é importante para demonstrar a presença de proteínas em materiais biológicos, como também para quantificá-las, uma vez que o complexo cobre-proteína apresenta uma absorção máxima 54 5nm; a intensidade da cor depende exclusivamente da concentração de proteína. Para que a reação do Biureto seja positiva há necessidade da presença de pelo menos duas ligações peptídicas na molécula, portanto, aminoácidos e dipeptídeos não dão reação do Biureto positiva. ● 4. Qual é a importância das reações de precipitação de proteínas por reagentes dos alcalóides e por sais de metais pesados? R: Os cátions de metais pesados como Hg 2+, Pb2+, Cu2+, Fe 2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elemento formador (ex: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc. ). Essa precipitação é mais inten sa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, acima do p I, a carga líquida sobre a proteína é negativa, favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal. Quando a proteína está abaixo do seu pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação da molécula com os ânions provenientes de ácidos como o tunguístico, o fosfotunguístico e o pícrico. Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de alterações do pH. Verifica-se que na adição de sais de metais pesados como de ácidos orgânicos fortes ocorreram precipitação. ● 5. Explique os mecanismos que levam uma proteína a se dissolver quando há um pequeno aumento na força iônica da solução e os mecanismos que levam uma proteína a precipitar quando há um grande aumento na força iônica da solução. R: ● 6. Que mudanças ocorrem com uma proteína quando em contato com etanol? R: A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água apresenta constante dielétrica bastante elevada (aproximadamente 80). Numa solução contendo, exclusivamente, água e moléculas protéicas temos: interação água - proteína e interação proteína -proteína. Nesse caso, podemos afirmar com certeza que o primeiro tipo de interação prevalecerá sobre o segundo porque a água possui grande capacidade de separação das
partículas do soluto (constante dielétrica elevada). Os solventes orgânicos apresentam valor de constante dielétrica bem inferior à da água, a interação proteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água (interação água-proteína). A proteína precipita. A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da conformação proteica. CONCLUSÕES Ao realizar os experimentos, foi possível observar a propriedade da proteína aqui discutida, a solubilidade. E, de acordo com a observação e o estudo detalhado, conclui-se que as proteínas sofrem alterações causadas pela desnaturação quando expostas ao calor, ácidos, sais, metais pesados, entre outros, que resultam na diminuição da solubilidade, perda de atividade, alteração na viscosidade, etc.
