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Etapas de Clarificação Centrifugação: esta etapa de clarificação é empregada quando o produto que se deseja separar está associado às células ou quando a esterilização é necessária. Neste processo ocorre a aceleração da sedimentação de partículas, separando-as do meio líquido, por meio da ação de um campo gravitacional centrífugo. Após a centrifugação, formam-se duas fases: uma líquida, denominada sobrenadante, e uma sólida, denominada “ pellet ” (SCHMIDELL, 2001). Filtração: este processo é utilizado para clarificar grandes volumes de suspensões diluídas de células, produtos extracelulares e quando não há necessidade de esterilização. Neste tipo de clarificação, a suspensão é forçada perpendicularmente a permear um meio filtrante, sendo a fração que atravessa este meio denominada de filtrado e aquela que, mesmo sob pressão, não atravessa o meio é denominada de “torta de filtração” (SCHMIDELL, 2001). Microfiltração: este tipo de filtração é constituído por um sistema de membranas com poros de diâmetro entre 0,05 e 3 um organizadas, geralmente, no formato de tubos ou placas. Estes sistemas podem ser compostos por uma ou mais membranas e são denominados de sistemas de filtração tangencial quando o fluido de alimentação escoa tangencialmente à superfície do meio filtrante (SCHMIDELL, 2001). Purificação de Baixa Resolução Extração em sistemas de duas fases aquosas: estes processos de extração, constituído por uma fase aquosa e um solvente, é utilizado para purificação de antibióticos, ácidos orgânicos produtos obtidos de células animais/vegetais/microbianas e para separação de vírus/organelas/ácidos nucleicos. Nesses sistemas, a molécula desejada e as impurezas são separadas de acordo com suas solubilidades. Dessa forma, este método se torna mais vantajoso em relação à centrifugação já que clarifica e fraciona as proteínas diminuindo a quantidade de operações unitárias necessárias para separação, enquanto que o processo de centrifugação demanda de elevada força centrífuga para sedimentação de pequena quantidade de sólidos (SCHMIDELL, 2001). Precipitação: esta técnica é vista como um método de moderada capacidade de separação de diferentes moléculas e pode preceder processos de elevada resolução. Em relação às proteínas, a precipitação pode ser feita em altas concentrações salinas ou com a adição de solventes. Altas concentrações de sais reduzem a disponibilidade de moléculas de água associadas às zonas hidrófobas das proteínas promovendo interação entre elas, o que ocasiona a precipitação. Já a utilização de solventes provoca a
precipitação por meio da redução da densidade da água e da atividade de água causada pela diminuição da constante dielétrica do meio (SCHMIDELL, 2001). Ultrafiltração: este tipo de filtração, assim como a microfiltração, é constituído com um sistema de membranas, porém o diâmetro dos poros varia entre 0,001 e 0,1 um. Além disso, este processo é utilizado para a concentração de macromoléculas, separando-as de caldos fermentados diluídos e/ou concentrando-as a baixa temperatura e pressão, possibilitando a retirada de sais e mantendo o pH do meio constante. Esta técnica pode ser utilizada para separação de proteínas de acordo com o tamanho das moléculas, porém, devido à não uniformidade dos poros, a resolução é baixa (SCHMIDELL, 2001). Gel filtração: este método, também conhecido como cromatografia de exclusão por tamanho, é realizado em colunas empacotadas com material poroso onde as moléculas de maior tamanho são as primeiras a serem eluídas. As matrizes empacotadas mais utilizadas são pequenas esferas naturalmente porosas (estireno-divinilbenzeno) ou que, após eluição do solvente, tornam-se porosas (NEVES et al., 1997). Este tipo de cromatografia é capaz de purificar biomoléculas específicas, como proteínas, glicoproteínas, ácidos nucléicos e polissacarídeos (GONÇALVES et al., 2014). Rompimento Celular O rompimento celular é a etapa que sucede o processo de clarificação e tem grande importância para as indústrias alimentícias e farmacêuticas, por exemplo. Esta importância está associada à necessidade de obter produtos que são gerados dentro das células, ou seja, é preciso romper a parede celular para adquirir estes produtos intracelulares (VITOLO et al., 2015). O processo de rompimento celular pode ser realizado de quatro diferentes formas: a partir de forças mecânicas (homogeneizador de alta pressão, moinho de bolas e ultrassom), não-mecânicas (choque osmótico, congelamento/descongelamento e secagem), por reações químicas (álcalis, solventes, detergentes e ácidos) e pela ação de enzimas (lise enzimática ou inibição da síntese da parede celular). Para a escolha do método mais eficiente para realizar determinado rompimento deve se levar em consideração fatores como: rendimento, especificidade, necessidade de controle de temperatura, custo da operação unitária e capital investido (SCHMIDELL, 2001). Métodos Mecânicos: os equipamentos mais utilizados industrialmente são o homogeneizador de alta pressão e o moinho de bolas, a técnica que utiliza ultrassom é a menos utilizada uma vez que apresenta alto custo de operação (SCHMIDELL, 2001). A homogeneização sob alta pressão provoca o rompimento das células pela descompressão que ocorre após a passagem da suspensão através de um pequeno orifício ligado a uma câmara com pressão atmosférica. (TREVAN et al., 1990). Diferente do homogeneizador que ocasiona a ruptura da célula por meio da pressão, o
Cromatografia A cromatografia é uma técnica quantitativa utilizada para identificação de bioprodutos, separação e purificação de misturas. Este processo ocorre a partir de duas fases: móvel e estacionária. A fase móvel é responsável por transportar as biomoléculas sobre a fase estacionária, obtendo como resultado uma distribuição diferencial dos solutos que interagem com a fase estacionária por meio de forças intermoleculares/iônicas e, assim, promovem a separação. O sistema cromatográfico é constituído por uma coluna onde a fase estacionária (polímero) é depositada e por onde a fase móvel (solvente) é introduzida. Industrialmente, os métodos de cromatografia mais empregados para purificação de bioprodutos são a gel filtração e troca iônica, todavia, existem também processos de interação hidrofóbicas e de afinidade (SCHMIDELL, 2001). Gel filtração: neste processo, as biomoléculas são separadas de acordo com seu volume efetivo na solução, portanto, a dimensão dos poros do gel e o tamanho das partículas do soluto são fatores que influenciam diretamente na eficiência da separação. As moléculas que possuem tamanho superior ao volume do poro são removidas da coluna através do eluente, enquanto que aquelas que possuem igual ou menor volume em comparação ao poro adentram na fase estacionária e são arrastadas pela fase móvel. Em relação às matrizes empregadas neste tipo de cromatografia, polímeros vinílicos hidrofílicos ou agarose com elevada proporção de ligações cruzadas são as mais utilizadas e apresentam poros que podem variar de 5 a 50 um (SCHMIDELL, 2001). Cromatografia de troca iônica: esta técnica é realizada em três etapas, separadamente: carga e eluição das amostras e regeneração da fase sólida. Primeiramente, a proteína é adsorvida na matriz ionizada e, em seguida, promove-se a dessorção desta proteína a partir da aplicação do eluente. Por fim, remove-se da fase estacionária as proteínas que permaneceram na coluna mediante a restauração da carga iônica original. Este método se baseia na afinidade entre as biomoléculas e a matriz ionicamente carregada. Dessa forma, a fase estacionária é eletricamente carregada para, então, ser capaz de adsorver os solutos de carga oposta transportados pela fase móvel. Em relação às matrizes utilizadas, características como porosidade, origem (natural ou sintética; orgânicas ou inorgânicas) e insolubilidade em água e em solventes orgânicos as classificam em diferentes grupos (SCHMIDELL, 2001). Cromatografia por interação hidrofóbica: neste método, a fase móvel possui maior concentração de solvente orgânico em relação à concentração de água e, como fase estacionária, são utilizadas matrizes polares capazes de interagir hidrofilicamente com solutos de mesma polaridade. Dessa forma, nesta técnica, as moléculas polares são as mais retidas enquanto que em outros processos de cromatografia, como a cromatografia líquida de fase reversa, as moléculas polares são as menos retidas. As matrizes mais utilizadas são sílica híbrida (poros de 2 um) e monolítica ou sílicas modificadas quimicamente. Além de interações hidrofílicas, ligações de hidrogênio, interações
eletrostáticas, forças de van der Waals e adsorção também podem ocorrer entre as biomoléculas e a fase estacionária (SILVA et al., 2016). Cromatografia por afinidade: este procedimento se baseia na interação física de adsorção entre a biomolécula e a fase estacionária e é realizado em quatro etapas: equilíbrio da coluna, injeção da amostra, lavagem da coluna para eluição das biomoléculas fracamente adsorvidas e, por fim, a eluição das biomoléculas adsorvidas (ARAÚJO et al., 2014). Além disso, os métodos utilizados para realizar este processo são divididos em dois grupos: frontais e de pulso. Estes podem ser aplicados para separação de biomoléculas com diferentes graus de afinidade com a fase estacionária, possibilitando a medição de parâmetros das interações entre as duas fases e a quantidade de adsorbato presente na amostra aplicada. Já os métodos frontais são utilizados para purificação de uma biomolécula específica, ou seja, a matriz sólida possui afinidade por um único componente da amostra aplicada (CHASE, 1984). REFERÊNCIAS ARAÚJO, Jéssica Morais de et al. Determinação da atividade antitríptica em proteínas de produtos do amendoim isoladas por cromatografia de afinidade. Química Nova , v. 37, n. 10, p. 1618-1623, 2014. CHASE, Howard Allaker. Prediction of the performance of preparative affinity chromatography. Journal of Chromatography A , v. 297, p. 179-202, 1984. ESCALLÓN, Ana María Vélez et al. Produção de penicilina G acilase por organismos geneticamente modificados. 2013. FLEURI, Luciana Francisco; SATO, Hélia Harumi. Produção, purificação, clonagem e aplicação de enzimas líticas. Química Nova , v. 28, n. 5, p. 871-879, 2005. GECIOVA, Jana; BURY, Dean; JELEN, Paul. Methods for disruption of microbial cells for potential use in the dairy industry—a review. International Dairy Journal , v. 12, n. 6, p. 541-553, 2002. GONÇALVES, Edilaine Della Valentina et al. Cromatografia de filtração em gel para a purificação de moléculas protéicas e glicídidas a partir de nematóides fitopatogênicos. Scientia Agraria Paranaensis , v. 13, p. 353 - 357, 2014.
