PCR CONVENCIONAL:
Técnica considerada simples, moléculas de DNA ou RNA milhares ou milhões de vezes de uma forma
rápida.
Objetivo de gerar(amplificar) amostras para analisar posteriormente.
PCR em tempo real:
Baseado no PCR Convencional, com monitoramento em tempo real do fragmento de interesse.
Monitoramento da fluorescência aumenta proporcionalmente a quantidade de material genético
amplificado.
Nested PCR: Produto PCR anterior
É o mesmo do convencional. A diferença é que a origem da amostra contendo o material genético que
você usará na reação, ao invés de uma amostra primária, utiliza-se uma amostra de uma PCR anterior.
Ou seja é a PCR do produto de outra PCR.
Aumenta a sensibilidade e especificidade nos casos em que as amostras não são muito boas.
*QUAL TÉCNICA É A MELHOR PARA MEDIR A ESPECIFICIDADE DA AMOSTRA? - Nested
PCR
Eletroforese:
Moléculas apresentam carga elétrica A eletroforese em gel de DNA é incorporada em várias técnicas
como uma técnica preparativa em biologia molecular, como PCR, sequenciamento de DNA,
mapeamento de genoma e Southern blotting. Uma eletroforese em gel pode ser executada
horizontalmente e verticalmente, no entanto, os géis padrão de DNA e RNA são executados
horizontalmente. DNA e RNA são moléculas carregadas negativamente, uma vez que são carregados no
gel da extremidade negativa do gel e expostos a um campo elétrico, eles migram através dos poros do
gel em direção à extremidade positivamente carregada do gel. Os géis para separação de DNA ou RNA
são freqüentemente feitos de um polissacarídeo chamado agarose que forma a matriz de gel. Quando a
agarose é aquecida em um buffer e resfriada, ela irá formar um gel sólido. A matriz de gel atuará como
uma peneira; quanto maior a concentração de agarose, menores os poros criados na matriz de gel, e mais
difícil para as grandes moléculas lineares de DNA se moverem através da matriz. Fragmentos de
tamanhos diferentes migrarão em taxas diferentes, permitindo que o pesquisador identifique o
fragmento de interesse entre uma amostra mista. Após a eletroforese, o gel pode ser visualizado sob luz
ultravioleta graças à adição de intercalador de DNA, como o brometo de etídio, ao gel de corrida.
Visualizando os fragmentos de DNA: Quando a corrida termina, o gel é colocado sob uma fonte de luz
UV. Graças à adição do brometo de etídio, os fragmentos de ADN ligados ao intercaeletor irão brilhar e
tornar-se visíveis como bandas distintas ao longo do comprimento do gel. O tamanho exato de cada
banda de DNA é detectado pela adição de um marcador molecular formado por várias bandas de
tamanho conhecido. Os tampões de eletroforese são usados para fornecer íons que transportam uma
corrente e para manter o pH em um valor relativamente constante. Os tampões de electroforese mais
comuns para ácidos nucleicos são Tris / Acetato / EDTA (TAE), Tris / Borato / EDTA (TBE). Além
disso, 0,2-0,5 μg / mL de brometo de etídio serão adicionados ao tampão.
Eletroforese de Proteína: As proteínas não são carregadas negativamente e, como tal, não podem ser
separadas pela aplicação de um campo elétrico. Para superar este problema, detergente de sódio dodecil
sulfato é adicionado à solução de proteína, a fim de separar as proteínas usando eletroforese em
gel. Este tratamento faz com que as proteínas se desdobrem em uma forma linear, cobrindo-as com um
revestimento carregado negativamente. Este revestimento negativo permite que as proteínas migrem
para a extremidade carregada positivamente de um gel e, portanto, sejam separadas por peso molecular.
O objetivo do uso de mancha é ter um fundo claro com faixas de proteína coradas de azul. Embora os
fragmentos de DNA possam ser imediatamente visualizados sob luz UV, os fragmentos de proteínas
precisam ser marcados com anticorpos específicos para o alvo, um processo conhecido como
imunocoloração. Esta reação não pode acontecer em um substrato de gel; as proteínas devem ser
transferidas para uma membrana (principalmente PVDF ou Nitrocelulose) e depois transferidas para
uma solução contendo um anticorpo que irá reconhecer e ligar especificamente a proteína de interesse.
