PCR EM TEMPO REAL - aula, Notas de aula de Biomedicina

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Dr Robson Francisco Carvalho

rfcarvalho@ibb.unesp.br

Departamento deMorfologia

PCR em Tempo Real

PCR em tempo real

• Pobre precisão
• Baixa sensitividade
• Curta extensão dinâmica (< 2 logs)
• Baixa resolução
• Não automatizado

O que há de errado com os géis de agarose?

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

• Resultados não são expressos em números
• Colorações não são muito quantitativas
• Pós-processamento do produto da PCR
• Contaminação (brometo)
• Discriminação baseada apenas no tamanho do fragmento

O que há de errado com os géis de agarose?

PCR em tempo real

Vantagens do PCR em tempo real:

→ Não é influenciado por amplificação não-específica (sondas) → Amplificação pode ser monitorada em tempo real → Ciclos mais rápidos → Detecção de alteração menor que 2x

Gel de agarose

5x

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Vantagens do PCR em tempo real:

→ Maior extensão dinâmica (de até 10^10 x) → Requer 1000x menos DNA que demais ensaios (3 picogramas = 1 genoma) → confirmação da amplificação específica (análise da curva de melting) → MAIS ESPECÍFICO, SENSÍVEL e REPRODUZÍVEL → Não é muito mais caro que a PCR convencional (exceção: preço do equipamento) PCR em tempo real

FASES DA PCR:

→ Exponencial: Dobro do produto é acumulado em cada ciclo (eficiência da reação ~100%). Reação específica e precisa. → Linear: Alta variabilidade (consumo dos componentes da reação) → Platô: Detecção por gel para os métodos tradicionais. Produtos não são mais produzidos e começam ser degradados PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

FASES DA PCR:

PCR em tempo real

F Q

…...^

T …...

1. Polimerase encontra o primer.

2. Laser excita a

sonda fluorescente

do primer.

3. Florescência

é absorvida

pela molécula

inibidora Q.

4. Detector registra “no reaction”.

F Q

T …...

5. Primer estendido pela Polimerase.

PCR em Tempo Real

F Q

…...^

T …...

6. Extensão continua até a

polimerase encontrar a molécula

fluorescente.

7. polimerase quebra o primer

marcado. A sonda fluorescente e a

molécula inibidora são liberadas.

F Q

T

Q

F Q

8.marcados são degradados e O PCR continua, os primers F

moléculas fluorescentes “livres”

são acumuladas.

9. O detector grava a fluorescência

como medida do progresso de

amplificação.

PCR em Tempo Real

Montagem da reação:

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

PCR em tempo real

Terminologia:

→(ruído liberado pela reação-background) Baseline: fluorescência do amplicon = fluorescência do meio

• ciclo da PCR com poucas mudanças no sinal de fluorescência PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Terminologia:

PCR em tempo real

Terminologia:

→ Threshold:manualmente), utilizado para a determinação do CT nível de ∆Rn (determinado automaticamente ou → Acima do Baseline e dentro da fase exponencial da curva PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Terminologia:

PCR em tempo real

Terminologia:

PCR em tempo real

PCR em Tempo Real

Terminologia:

PCR em tempo real

Diluição de uma mesma amostrathreshold

CT