A pesquisa celular é dependente de técnicas laboratoriais para a análise de suas estruturas e funções. Devido a isto estudaremos as formas de observação, preparo e coloração de amostras celulares. Iremos analisar qual a forma de microscopia mais adequada para cada tipo de amostra e como realizar a preparação destas.

Tipologia: Notas de estudo

2012

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO RIO GRANDE DO SUL

UNIDADE EM BENTO GONÇALVES

CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA

MONICHARA MARINELLO

MÉTODOS DE ESTUDO DA CÉLULA

BENTO GONÇALVES

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

LISTA DE SIMBOLOS

μ – Micrômetro

μ – Micro

λ – Comprimento de onda

NA – Abertura numérica

nm – nanômetros

X – vezes

SUMÁRIO

Figura 1 – Micrografia de Células Humanas obtidas com microscopia..........................
Figura 2 – Microscopia Fluorescente de uma célula de pulmão....................................
Figura 3 – Micrografia confocal de células de embrião de camundongo.......................
Figura 4 – Microscópio Eletrônico de Transmissão........................................................
Figura 5 – Microscópio Eletrônico de Varredura............................................................
Figura 6 – Fracionamento Subcelular.............................................................................
1 INTRODUÇÃO
2 REFERENCIAL TEÓRICO ……………………………………………………………
2.1 TÉCNICAS DE BIOLOGIA CELULAR...................................................................
2.2 MICROSCOPIA ÓTICA.........................................................................................
2.2.1 Microscópio Ótico Composto (MO) ....................................................................
2.2.2 Microscópio de Campo Claro .............................................................................
Interferência .................................................................................................................... 2.2.3 Microscópio de Contraste de Fase e Microscópio de Contraste de
2.2.4 Microscopia de Campo escuro .........................................................................
2.2.5 Microscopia de Fluorescência ..........................................................................
2.2.6 Microscopia Confocal ........................................................................................
2.2.7 Microscopia de excitação de dois fótons ........................................................
2.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA...........................................................................
2.3.1 Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) ..............................................
2.3.2 Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) ...................................................
2.4 MICROSCOPIA DE TUNELAMENTO (MT).........................................................
2.5 MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (MFA)...................................................
2.6 FRACIONAMENTO SUBCELULAR....................................................................
2.6.1 Centrifugação .....................................................................................................
2.7 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA MICROSCOPIA OTICA.......................
2.7.1 Coloração simples .............................................................................................
2.7.2 Coloração Diferencial ........................................................................................
2.7.2.1Coloração Gram..................................................................................................
2.7.2.2Coloração de resistência ao álccol-ácido............................................................
2.7.3 Coloração especial ............................................................................................
3 CONCLUSÃO ......................................................................................................
REFERÊNCIAS ...................................................................................................

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 TÉCNICAS DA BIOLOGIA CELULAR

Conforme Cooper (2001, p44): “[...] a pesquisa em biologia celular depende de técnicas laboratoriais que possam ser usadas para estudar a estrutura e função celular. O exame de metodologias experimentais disponíveis para a biologia celular é essencial para a compreensão tanto da situação atual como das futuras direções dessa área de avanço rápido da ciência.”

“Existem diversas técnicas para observação de detalhes ampliados de superfícies, como, por exemplo, com lentes, usando um microscópio ótico, inventado no século XVIII.” (DUARTE; FABIANO C. p01). Estas técnicas de extrema importância para a biologia celular serão descritas detalhadamente neste referencial teórico.

2.2 MICROSCOPIA ÓTICA

“A principal função de qualquer microscópio é tornar visível ao olho humano o que for muito pequeno para tal.O limite máximo de resolução dos microscópios ópticos é estabelecido pelos efeitos de difração devido ao comprimento de onda da radiação incidente. Os microscópios ópticos convencionais ficam, então, limitados a um aumento máximo de 2.000 vezes, porque acima deste valor, detalhes menores são imperceptíveis. Para aumentar a resolução pode-se utilizar uma radiação com comprimento de onda menor que a luz visível como fonte de iluminação do objeto. Além disso, a profundidade de campo é inversamente proporcional aos aumentos, sendo necessário, então, um polimento perfeito da superfície a ser observada, o que às vezes é incompatível com a observação desejada. (KESRENBACHK, 1994 apud DEDAVID, BERENICE A., 2007, p9). “Já que a maioria das células é muito pequena para ser vista a olho nu, o estudo das células depende fortemente do uso de microscópio.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, P44).

“A microscopia ótica consiste em analisar a superfície da amostra fornecendo uma imagem produzida pela interação entre a luz e a amostra, com um campo de observação bastante amplo.” (LEITE, M. C. A. M. ET AL. 2010, VOL 20, Nº Especial, p40). “O objetivo da microscopia é a obtenção de imagens ampliadas de um objeto, que nos permitam distinguir detalhes não revelados a olho nu.” (MANNHEIMER; WALTER A. 2002, Cap II, p01). Conforme Baroni (2006, p179) “Um dos meios auxiliares mais úteis para compreender a estrutura dos materiais é a observação de sua imagem usando um microscópio óptico ou eletrônico.” Conforme Cooper (2001, p44): [...] a descoberta das células resultou do desenvolvimento do microscópio: Robert Hooke inventou o termo “célula” após suas observações de um pedaço de cortiça com um microscópio ótico simples, em 1665. [...] Antony Van Leeuwenhoek, por volta de 1670, foi capaz de observar uma grande variedade de tios celulares diferentes, [...].” “O microscópio simples usado por Van Leeuwenhoek no século XVII possuía somente uma lente e era similar a uma lupa de ampliação. [...] Suas lentes eram polidas com tamanha precisão que uma única lente podia ampliar um microscópio 300vezes, com uma resolução de 1μm.” (TORTORA; GERARD J. p57). “Consequentemente, em razão das observações feitas com o microscópio ótico, a célula foi reconhecida como a unidade fundamental de todos os organismos vivos.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p44 e 45). Conforme Duarte (p01) “[...] esses instrumentos ópticos possuem a limitação do comprimento de onda da luz visível, dada pelo critério da difração de Rayleigh [...]”. Porém “o microscópio ótico permanece como um instrumento básico dos biologistas celulares, com aperfeiçoamentos técnicos permitindo a crescente visualização de detalhes da estrutura celular.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p45). “Os microscópios óticos atuais são capazes de ampliar objetos até mil vezes. Já que a maioria das células tem entre 1 e 100μ de diâmetro, elas podem ser observadas por microscopia ótica [...]”.(COOPER; GEOFFREY M. 2001, p45). Conforme Cooper (2001, p45):

brilhante.” (TORTORA; GERARD J. p58). Já Cooper classifica este tipo de iluminação como Microscopia de campo claro.

Conforme Cooper (2001, p46): “O mais simples é a microscopia de campo claro, no qual a luz passa diretamente através da célula e a habilidade de distinguir diferentes partes da célula depende do contraste resultante da absorção da luz visível pelos componentes celulares."

A microscopia de campo claro é uma “Técnica amplamente usada em microscopia, a qual baseia-se na observação de espécimes corados sob campo de iluminação uniforme. Muito utilizada no campo de anatomia vegetal para coloração geral ou específica de componentes celulares.” (BALDANI,V.L.D. ; EMBRAPA- CNPAB;1998, p10) “Em muitos casos, células são coradas com corantes que reagem com proteínas e ácidos nucleicos com o objetivo de aumentar o contraste entre as deferentes partes da célula.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p46). “Entretanto, esse procedimento de coloração mata as células e, portanto, não são adequados para muitos experimentos, nos quais a observação de células vivas é desejável.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p46). “Nem sempre é desejável corar uma amostra. Contudo, uma célula sem coloração possui pouco contraste com suas vizinhanças, e assim, é difícil de ver.” (TORTORA; GERARD J. p58 e 59). “Entretanto, variações óticas do MO podem ser usadas para aumentar o contraste entre as ondas de luz que passam através das regiões da célula com densidades diferentes”. (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p46).

2.2.3 Microscópio de Contraste de Fase e Microscópio de Contraste de Interferência

“Dois dos métodos mais comuns para visualização de células vivas são microscopia de contraste de fase e a microscopia de contraste de interferência

diferencial.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p46). “Ambos os tipos de microscopia usam sistemas óticos que convertem variações de densidade ou espessura entre partes diferentes da célula em diferenças no contraste que podem ser vistas na imagem final.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p46). A microscopia de “Campo escuro, contraste de fase e de interferência são técnicas óticas de contraste que tem como principal vantagem, a possibilidade de observação das preparações in vivo com clareza sem a necessidade de fixação e coloração das células, o que poderia trazer alterações morfológicas ao espécime.” (BALDANI,V.L.D.; EMBRAPA-CNPAB;1998, p11) “A microscopia de contraste de fase e a de contraste de interferência diferencial convertem essas diferenças na fase para diferenças no contraste, desse modo produzindo melhora nas imagens de células vivas não coradas.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p46 e 47). Figura 1 – Micrografia de células humanas obtidas com microscopia de (A) campo claro, (B) contraste de fase e (C) contraste de interferência diferencial.

Fonte: (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p47)

identificadas.” “Esta técnica é frequentemente usada para examinar microrganismos não-corados suspensos em liquido.”

2.2.4 Microscopia de Campo escuro

“A microscopia de campo escuro prioriza o aumento de contraste com perda significativa de resolução, sendo mais indicada para visualização de estruturas lineares como por exemplo flagelos.” (BALDANI,V.L.D.; EMBRAPA-CNPAB;1998, p11).

2.2.5 Microscopia de Fluorescência

“A microscopia de fluorescência é um método muito sensível e amplamente usado para o estudo da distribuição intracelular da molécula.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p47). “A principal utilização da microscopia de fluorescência é uma técnica diagnostica denominada técnica de anticorpo fluorescente (AF) ou imunofluorescência.” (TORTORA; GERARD J. p62). “Esta técnica baseia-se no uso de corantes fluorescentes ou fluorocromos para visualização do espécime. Estes se ligam a componentes da célula microbiana e sob excitação ultravioleta ou radiação eletromagnética na faixa do visível de baixo comprimento de onda, emitem radiação com comprimento de onda superior à radiação incidente.” (BALDANI,V.L.D.; EMBRAPA-CNPAB;1998, p12). “Esta técnica pode detectar bactérias ou outros microrganismos patogênicos, mesmo dentro das células, dos tecidos ou de outras amostras clínicas. Além disso, pode ser usada para identificar um micróbio em poucos minutos.” (TORTORA; GERARD J. p62).

Figura 2: Microscopia fluorescente de uma célula de pulmão na qual o DNA é corado em azul e os microtúbulos no citoplasma são corados em verde.

Fonte: (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p48).

2.2.6 Microscopia Confocal

“A combinação de diversas técnicas de microscopia de luz amplia sobremaneira a gama de informações obtidas ao microscópio [...].O uso de técnicas complementares ganhou aliados importantes, o computador e a câmera de vídeo.” (BALDANI,V.L.D.; EMBRAPA-CNPAB;1998, p13). “A microscopia confocal combina a microscopia de fluorescência com a análise eletrônica de imagens para obter imagens tridimensionais.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p47). “[...] um plano de uma pequena região de uma amostra é iluminada com um laser, que passa a luz devolvida através de uma abertura alinhada com a região iluminada.” (TORTORA; GERARD J. p63). “Uma vez que a microscopia confocal usa uma abertura puntiforme, elimina o barramento que ocorre com outros microscópios. Como resultado, imagens bidimensionais excepcionalmente claras podem ser obtidas, com uma resolução de até 40% melhor que a dos outros microscópios.” (TORTORA; GERARD J. p63). Tortora enfatizou que “[...] a microscopia confocal pode ser usada para avaliar à fisiologia celular, monitorando as distribuições e as concentrações de substâncias como o ATP e os íons cálcio."

eletrônicos são usados para examinar estruturas muito pequenas.” (TORTORA; GERARD J. p63). “Ao invés de utilizar lentes de vidro, um microscópio eletrônico usa lentes eletromagnéticas para focalizar a amostra um feixe de elétrons que viaja através de um tubo com vácuo.” (TORTORA; GERARD J. p63). “Com o estabelecimento do microscópio eletrônico como ferramenta científica, os microbiologistas ampliaram seu potencial de percepção de detalhes estruturais, previamente limitados pelo comprimento de onda da luz visível.” (BALDANI,V.L.D.; EMBRAPA-CNPAB;1998, p13). “A microscopia eletrônica tem sido utilizada para o diagnóstico morfológico das doenças glomerulares por mais de três décadas e seu valor sido amplamente enfatizado. A sua utilização em outras áreas da diagnóstico como doenças tumorais tem declinado consideravelmente tendo em vista a inevitável pressão financeira para redução de custos da investigação e rotinas de diagnóstico, [...].” (SEMENTILLI,ANGELO, Medical Journal, 2004, p104).

Existem dois tipos de microscópios eletrônicos que amplamente utilizados para estudar as células – de transmissão e de varredura. (TORTORA; GERARD J.;. COOPER; GEOFFREY M. 2001).

2.3.1 Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)

“O microscópio eletrônico de transmissão convencional, tem se constituído numa ferramenta valiosa para interpretação ultraestrutural da relação entre bactérias diazotróficas e a planta hospedeira. Seções ultrafinas do espécime são necessárias para que o feixe de elétrons atravesse a amostra e uma imagem seja formada.” (BALDANI,V.L.D.; EMBRAPA-CNPAB;1998, p14). “O MET pode oferecer resolução a objetos tão próximos como 2,5 nm, e os objetos geralmente são ampliados em 10.000 a 100.000X. Como a maioria das amostras microscópicas é tão fina, o contraste entre suas ultra-estruturas e o fundo [e fraco. ” (TORTORA; GERARD J. p63).

“Amostras para serem examinadas por MET podem ser preparadas por coloração negativa e positiva. Na coloração positiva, os tecidos da amostra são cortados em secções finas e coradas com sais de metais pesados [...]. A coloração negativa é útil para a visualização de estruturas biológicas intactas [...].” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p50). “A MET tem alta resolução e é extremamente valiosa para examinar camadas diferentes de amostras.” (TORTORA; GERARD J. p64). Segundo Tortora o método de MET possui algumas desvantagens como: a) os elétrons possuem potencia limitada de penetração; b) a amostra não tem aspecto tridimensional; c) as amostras devem ser fixadas, desidratadas e examinadas em alto vácuo; d) os tratamentos empregados a amostra podem matar, causar encolhimento e distorção; e) os tratamentos podem causar a ilusão de aparecimento de estruturas adicionais em células preparadas.

“O sombreamento metálico é outra técnica usada para visualizar a superfície de estruturas subcelulares isoladas ou macromoléculas com o MET.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p50). “O metal se acumula de um lado da amostra e deixa uma área clara atrás dele, como uma sombra. Isto dá um efeito tridimensional à amostra, e fornece uma idéia geral do tamanho e forma da mesma.” (TORTORA; GERARD J. p64). Segundo Cooper a preparação de amostras por criofratura, em combinação com o sombreamento metálico é importante nos estudos da estrutura de membranas. Para a realização deste tipo de analise a amostra deve ser congelada em nitrogênio líquido e depois ser quebrada com uma lâmina não-cortante. Este tipo de processo divide a bicamada de lipídios revelando as faces interiores da membrana celular. Após a amostra deve ser recoberta com platina e o material biológico dissolvido com acido, produzindo uma réplica metálica da superfície da amostra que revela muitas alterações na superfície que correspondem as proteínas que atravessam a bicamada de lipídios.

Diversos autores descrevem que um MEV fornece imagens tridimensionais das amostras. (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p51; TORTORA; GERARD J. p64). “O MEV é especialmente útil para estudar as estruturas de superfície de células intactas e vírus. [...] pode dar resolução a objetos com uma proximidade de até 20 nm, e os objetos geralmente são ampliados em 1.000 a 10.000X.” (TORTORA; GERARD J. p64).

Figura 5 – Microscópio Eletrônico de Varredura

Fonte: (TIMM; LILIAM de L.,Caderno La Salle XI, 2005, v.2, nº 1, p238)

2.4 MICROSCOPIA DE TUNELAMENTO (MT)

“[...] usa uma fina sonda metálica que varre a amostra e produz uma imagem que revela as protuberâncias e as depressões dos átomos na superfície da amostra. As MTs são usadas para fornecer vistas incrivelmente detalhadas de chips comutadores de silicone, bem como de moléculas como o DNA.” (TORTORA; GERARD J. p65).

2.5 MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (MFA)

“Na MFA uma sonda de metal e diamante é suavemente forçada sobre uma amostra. A medida que a sonda se move o longo da superfície da amostra, seus movimentos são registrados e uma imagem tridimensional é produzida. A MFA é utilizada para observar a estrutura detalhada das moléculas biológicas.” (TORTORA; GERARD J. p65 e 68).

2.6 FRACIONAMENTO SUBCELULAR

“Embora o microscópio eletrônico permita visualização detalhada da estrutura celular, a microscopia sozinha não é suficiente para definir as funções de vários componentes de células eucarióticas. [...] tem sido necessário isolar as organelas de células eucarióticas de modo que possam ser utilizadas para estudos bioquímicos.” (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p52). “Esta técnica permite que células inteiras sejam rompidas de maneira controlada. As diferentes partículas que resultam são separadas para análise funcional ou estrutural, através da centrifugação das células rompidas em soluções especializadas de densidade conhecida, à alta velocidade. Os núcleos, as mitocôndrias, os retículos endoplasmáticos e os ribossomos podem ser isolados em forma relativamente pura.” (TIMM; LILIAM de L.,Caderno La Salle XI, 2005, v.2, nº 1, p238) “A primeira etapa no fracionamento subcelular é a ruptura da membrana plasmática sob condições em que não ocorra a destruição dos componentes internos da célula. (COOPER; GEOFFREY M. 2001, p52). Cooper cita diversos métodos para a realização deste procedimento: a) sonificação; b) trituração com homogeneizadores; e c) tratamento com maceradores de alta velocidade.