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Este estudo investigou os efeitos psicostimulantes e citotóxicos de benzidamina (ben) em camundongos, avaliando seus efeitos no comportamento (campo aberto, inibição pré-pulso, labirinto em y, reconhecimento de objetos, interação social e rota rod) e nas concentrações de monoaminas (dopamina e serotonina). O estudo utilizou protocolos de tratamento agudo e repetido por sete dias com diferentes doses de ben. Além disso, foram observados efeitos periféricos, como a redução da função parassimpática da traquéia e a redução da contração induzida por metacolina no músculo liso traqueal.
O que você vai aprender
Tipologia: Teses (TCC)
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’ UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA MARIANA LIMA FEITOSA ESTUDO DO CLORIDRATO DE BENZIDAMINA: EFEITOS COMPORTAMENTAIS E NEUROQUÍMICOS EM CAMUNDONGOS E POSSÍVEIS EFEITOS CITOTÓXICOS EM CULTURA DE CÉLULAS DE ASTRÓCITOS. FORTALEZA-CE 2016
Tese apresentada à Coordenação do programa de Pós-graduação em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará para a obtenção do título de Doutora em Farmacologia. Orientadora: Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa FORTALEZA-CE 2016
Tese apresentada a Coordenação do Programa de Pós-graduação em Farmacologia para a obtenção do título de Doutora em Farmacologia. Aprovada em / /. **BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Francisca Cléa Florenço de Sousa - Orientadora Universidade Federal do Ceará – UFC Fortaleza
Profª. Drª. Lissiana Magna Vasconcelos Aguiar Universidade Federal do Ceará- UFC Sobral
Prof. Dr. Daniel Freire de Sousa Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-brasileira – UNILAB Redenção
Prof. Dra. Carla Thiciane Vasconcelos de Melo Universidade Federal do Ceará - UFC Sobral
Prof. Dr. Emiliano Ricardo Vasconcelos Rios Faculdade Metropolitana da Grande Fortaleza – FAMETRO Fortaleza**
À Profa. Danielle, por sempre ser uma luz na vida dos estudantes. Apenas uma conversa com a senhora fazia a nossa tão difícil pesquisa parecer bem mais simples. Obrigada pelas conversas de corredor que eu sempre perturbava a senhora e a senhora sempre com muita paciência me ouvia e sempre me ajudava! Aos meus queridos amigos Daniel, Thiago, Tatiane, Isabelle, Germana, Naiara, Manel, Caren, Adriano, Alana, Klistenes, Camila Nayane, Greicy, Pedro, Dayane, Ludmila, Valdécio, Jales e todos os outros. O dia com vocês é sempre mais alegre! Obrigada!! À Vilani e Lena, muito obrigada por toda a ajuda e pelos dias de muitas risadas no laboratório! A todos que aqui não descrevi, pois são muitos que fazem parte dessa história! Meu muito obrigada!!!
O cloridrato de benzidamina (BEN) trata-se um anti-inflamatório não esteroidal comercialmente vendido em muitos países e que tem propriedades anestésicas locais e para o alívio da dor. Altas doses de BEN administradas de forma aguda podem causar efeitos psicoestimulantes. O objetivo do presente estudo foi Investigar os efeitos psicoestimulantes em camundongos e citotóxicos em cultura de astrócitos do BEN_._ Para os testes comportamentais (campo aberto, inibição pré-pulso, labirinto em Y, reconhecimento de objetos, interação social e rota rod ) e para a dosagem de monoaminas, foram utilizados um protocolo de tratamento agudo e um de dose repetida por sete dias com as doses de 50, 100 e 200 mg/kg do BEN por via oral. Para a dosagem de BDNF, utilizou-se apenas o protocolo de administração de dose repetida. O estudo de citotoxicidade iniciou-se com o teste do MTT, onde foi realizado um screening de doses, sendo utilizadas as doses: 3,1; 6,2; 12,5; 25; 50 e 100 μg/mL por um período de incubação de 12 ou 24 horas. A análise por citometria para a investigação do tipo de morte celular envolvido com a citotoxicidade do BEN utilizou as doses de IC50, IC50x2 e IC50/2 do período de incubação de 24h. Para as imunofluorescências, usou-se a dose de IC50 do período de incubação de 24h. Nossos resultados mostraram que BEN causou aumento da atividade locomotora, déficit no filtro sensório-motor, diminuição de cognição e isolamento social em ambos os períodos de tratamento, sendo esses resultados semelhantes a outras drogas de abuso. A droga em estudo também causou alterações nas monoaminas, com aumento da taxa de metabolização da dopamina e depleção dos níveis de serotonina no tratamento agudo e aumento da taxa de metabolização da dopamina e aumento dos níveis de serotonina no tratamento de dose repetida. BEN também causou diminuição dos níveis de BDNF em corpo estriado. Os experimentos in vitro mostraram que BEN causou diminuição da viabiliadade celular no teste do MTT, sendo essa citotoxicidade causada pela ativação da via apoptótica verificada pela citometria de fluxo. Através de imunofluorescência, pôde-se confirmar que a via apoptótica envolvida com a citotoxicidade de BEN é a extrínseca, pois houve
Benzydamine hydrochloride (BEN) is a non-steroidal anti-inflammatory commercially sold in many countries that has local anesthetic and relief pain properties. Acute high doses of BEN can cause psychostimulants effects. The aim of this study was to investigate the psychostimulant effects in mice and the cytotoxic effect in astrocyte cultures.For the behavioral tests (open field, pre-pulse inhibition, Y-maze, object recognition, social interaction and rota rod ) and for the monoamines assay, it was used an acute treatment protocol and a repeated dose for seven days protocol with BEM doses of 50, 100 and 200 mg/kg orally. For BDNF measure, we used only the repeated dose administration protocol. The cytotoxicity study began with the MTT test, which was performed a screening of doses (3.1; 6.2; 12.5; 25; 50 and 100 ug/ml) for a period of 12 or 24 hour of incubation. The cytometric analysis, used to investigate the type of cell death involved in the cytotoxicity of BEN, used the doses of IC50, IC50x2 and IC50/ 2 of the 24h incubation period. For immunofluorescence, it was used the IC50 dose of the 24h incubation period. Our results showed that BEN causes increased locomotor activity, deficit in sensorimotor filter, decreased cognition and social isolation in both periods of treatment, and these results are similar to other abuse drugs. The study drug also caused changes in monoamines, with increased dopamine metabolism rate and depletion of serotonin levels in the acute treatment and increased dopamine metabolism rate and increased serotonin levels in the repeated dose treatment. BEN also caused decreased BDNF levels in the striatum. In vitro experiments showed that BEN caused a decrease in cell viability in the MTT test, and this cytotoxicity in because of the activation of the apoptotic pathway verified by flow cytometry. By immunofluorescence, it was possible to confirm that the apoptotic pathway involved in BEN cytotoxicity is the extrinsic one, because there was an increase in the caspase- 8 enzyme expression and in the NFκB p transcription factor, whereas the caspase-9 enzyme, activated by intrinsic apoptosis pathway, there was no significant difference when compared to control group. In summary, this study showed that BEN, as well as other abuse drugs, has deleterious
effects on the Central Nervous System (CNS) seen through the behavioral tests, and these effects are caused by changes in monoamines and BDNF levels and activation of the extrinsic apoptotic pathway in astrocytes cells. Key-words: Benzydamine; Monoamines; Cytotoxic effect; Apoptosis.
Figura 19 - Efeito de BEN no teste de Interação Social após tratamento agudo............................................................................................... 71 Figura 20 - Efeito de BEN no teste de Interação Social após tratamento de dose repetida de 7 dias.................................................................... 72 Figura 21 - Número de quedas no teste do rota rod após tratamento agudo e de sete dias com BEN..................................................................... 74 Figura 22 - Efeito do tratamento agudo com BEN nas doses de 50, 100 e 200mg/kg sobre as concentrações estriatais de Dopamina, DOPAC e HVA................................................................................. 77 Figura 23 - Efeito do tratamento agudo com BEN nas doses de 50, 100 e 200mg/kg sobre a taxa de renovação de DA................................... 78 Figura 24 - Efeito do tratamento de dose repetida de sete dias com BEN nas doses de 50, 100 e 200mg/kg sobre as concentrações estriatais de Dopamina, DOPAC e HVA.......................................................... 79 Figura 25 - Efeito do tratamento de dose repetida de sete dias com BEN nas doses de 50, 100 e 200mg/kg sobre a taxa de renovação de DA... 80 Figura 26 - Efeito do tratamento agudo com BEN nas doses de 50, 100 e 200mg/kg sobre as concentrações estriatais de Serotonina (5-HT) e de ácido 5-hidroxi-indolacético (5-HIAA)....................................... 82 Figura 27 - Efeito do tratamento agudo com BEN nas doses de 50, 100 e 200mg/kg sobre a taxa de renovação de 5-HT................................ 83 Figura 28 - Efeito do tratamento de dose repetida de sete dias com BEN nas doses de 50, 100 e 200mg/kg sobre as concentrações estriatais de Serotonina (5-HT) e de 5 - hidroxi-indolacético (5-HIAA).............. 84 Figura 29 - Efeito do tratamento de dose repetida de sete dias com BEN nas doses de 50, 100 e 200mg/kg sobrea taxa de renovação de 5-HT. 85 Figura 30 - Efeito do tratamento de dose repetida de sete dias com BEN nas doses de 50, 100 e 200mg/kg sobre as concentrações do Fator Neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) no corpo estriado (A) e em hipocampo (B)............................................................................ 87 Figura 31 - Efeito de BEN sobre a viabilidade de astrócitos pelo método do MTT após 12 horas ou 24 horas de incubação................................ 88
Figura 32 - Citometria de Fluxo para a avaliação do tipo de morte celular envolvido na citotoxicidade de BEN após 24 horas de incubação com as doses IC50/2 (13,06 μg/mL), IC50 (26,13 μg/mL) e IC50X2 (52,26 μg/mL)...................................................................... 90 Figura 33 - Quantificação do tipo de morte envolvido na citotoxicidade de BEN após 24 horas de incubação com as doses IC50/2 (13, μg/mL), IC50 (26,13 μg/mL) e IC50X2 (52,26 μg/mL) através do experimento da Citometria de Fluxo................................................ 91 Figura 34 - Dupla coloração por imunofluorescência de culturas de astrócitos corticais para caspase-8 e DAPI após tratamento de 24h com BEN.................................................................................................. 93 Figura 35 - Quantificação da intensidade de imunofluorescência (IF) para caspase-8 em culturas de astrócitos corticais após tratamento de 24h com BEN................................................................................... 94 Figura 36 - Dupla coloração por imunofluorescência de culturas de astrócitos corticais para caspase-9 e DAPI após tratamento de 24h com BEN.................................................................................................. 95 Figura 37 - Quantificação da intensidade de imunofluorescência (IF) para caspase-9 em culturas de astrócitos corticais após tratamento de 24h com BEN................................................................................... 96 Figura 38 - Dupla coloração por imunofluorescência de culturas de astrócitos corticais para NFκB p65 e DAPI após tratamento de 24h com BEN.................................................................................................. 97 Figura 39 - Quantificação da intensidade de imunofluorescência (IF) para NFκB p65 em culturas de astrócitos corticais após tratamento de 24h com BEN................................................................................... 98
BEN - Cloridrato de Benzidamina SNC - Sistema Nervoso Central VTA - Área Tegumentar Ventral DA - Dopamina TDAH - Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade 5 - HT - Serotonina mg - miligrama Mmol - Milimol L - Litro DL50 - Dose Letal de 50% Kg - Kilograma i.p. - Intraperitoneal MTT - 3 - (4,5-dimetiltiazol- 2 - il)-2,5-difeniltetrazólio ROS - Espécies Reativas de Oxigênio TNFR - Receptor para o Fator de Necrose Tumoral TNFR1 - Receptor para o Fator de Necrose Tumoral Tipo 1 DISC - Complexo de Sinalização Indutor de Morte FADD - Domínio de Morte Associado ao Fas TRADD - Domínio de morte associado ao TNFR TRAF2 - Fator associado ao TNFR tipo 2 RIP1 - Proteína integrada ao receptor serina/treonina cinase tipo 1 FasL - Fas Ligante TRAIL - Ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF TRAILR - Receptor do ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF NFκB - Fator Nuclear kappa B IAPs - Proteínas Inibidoras de Apoptose Cit c - Citocromo c Apaf- 1 - Fator Ativador de Protease Apoptótica 1 BDNF - Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro rpm - Rotações por minuto 7 - AAD - 7 - amino-actino-micina IF - Imunofluorescencia
TPCS - Tempo de permanência na câmara social TIS - Tempo de interação social NECS - Número de entradas na câmara social CCET - Circuito cortico-estriado-talâmico DAPI - 4,6-diamidino- 2 - fenilindol SERT - Transportadores de 5-HT LSD - Dietilamida do ácido lisérgico GFAP - Proteína ácida fibrilar glial siRNA - Pequenos fragmentos de RNA GC - Guanina-citosina MAPKs - Proteínas cinases ativadas por mitógenos BH3 - Proteínas Bcl-2 homólogas 3 ATP - Trifosfato de adenosina ALE - Atividade locomotora espontânea IPP - Inibição pré-pulso ASR - Reflexo auditivo de sobressalto PPI - Inibição por estímulo prévio HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência SOS - Ácido octanosulfônico sódico DOPAC - Ácido 3,4-di-hidroxifenilacético HVA - Ácido homovanílico 5 - HIAA - Ácido 5 - hidroxiindoleacético PBS - Solução salina tamponada com fosfato ELIZA - Ensaio imunoenzimático DMEM - Meio de Eagle modificado por Dulbecco SDS - Dodecilsulfato de sódio BSA - Soro bovino fetal MDMA - Metilenodioximetanfetamina NADH - nicotinamida adenina dinucleotídeo IKKs - Cinases IkB
4.6. 4 Avaliação da via apoptótica envolvida com o efeito citotóxico do 5 .2. 3 Determinação das concentrações do Fator Neurotrófico Derivado
