ESTRUTURA CLONAL E MULTIRRESISTÊNCIA EM Pseudomonas aeruginosa, Teses (TCC) de Microbiologia

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LUCIANA LOBIANCO FERREIRA

ESTRUTURA C LONAL E MULTIRRESISTÊNCIA EM

Pseudomonas aeruginosa

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM VIGILÂNCIA SANITÁRIA

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

ESTRUTURA C LONAL E MULTIRRESISTÊNCIA EM

Pseudomonas aeruginosa

Luciana Lobianco Ferreira

Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde Fundação Oswaldo Cruz

Orientadora: Profª Dra Marise Dutra Asensi Laboratório de Enterobactérias Departamento de Bacteriologia IOC – Fundação Oswaldo Cruz

Rio de Janeiro Outubro de 2005

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Ferreira, Luciana Lobianco

Estrutura clonal e multirresistência em Pseudomonas aeruginosa ./ Luciana Lobianco Ferreira. Rio de Janeiro: INCQS/ FIOCRUZ, 2005.

xv, 99p., il., tab.

Dissertação em Vigilância Sanitária, Prog. Pós-Graduação em Vigilância Sanitária/ INCQS, 2005. Orientador: Marise Dutra Asensi.

1. Pseudomonas aeruginosa. 2. Resistência a antimicrobianos. 3. Metalo-β-lactamase. 4. Epidemiologia molecular.

I. Fundação Oswaldo Cruz - INCQS II. Título

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A MEU MARIDO, JOSÉ F ÁBIO

A MEUS PAIS , ANA LUCIA E ROGÉRIO

A MINHA AVÓ, LUCIANA

A MEU IRMÃO, BRUNO

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AGRADECIMENTOS

A Deus que por toda minha vida esteve presente, me dando saúde e força para tornar real meus ideais;

A minha mãe que incondicionalmente me apoiou, me incentivou e contribuiu para que mais esse sonho se concretizasse;

A meu pai que me mostrou o caminho do amor e da dignidade;

A meu marido, que me incentivou desde o início e me apoiou neste momento tão importante da minha vida;

A minha família e amigos pelo carinho e atenção;

A Dra. Marise Dutra Asensi pela confiança e orientação que tornaram possível a realização deste trabalho;

A Dra. Dália dos Prazeres Rodrigues pelo incentivo durante a realização do trabalho;

A amiga Maiara dos Santos de Araújo, pela contribuição na realização do trabalho e pelo companheirismo;

A toda equipe do Laboratório de Enterobactérias, por toda ajuda prestada e pela boa vontade;

Aos amigos e professores do curso de pós-graduação em Vigilância Sanitária, do INCQS-FIOCRUZ, que de alguma forma contribuíram para a minha formação;

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A Dra. Maria Helena Simões Villas Bôas, que desde o início de todo este processo se mostrou solícita para qualquer ajuda;

A Dra. Marisa Zenaide Ribeiro Gomes, pela colaboração interinstitucional;

A Dra. Marilene Rodrigues Chang, pela colaboração interinstitucional;

A Dra. Maria da Penha, pela colaboração interinstitucional;

A Dra. Maria da Penha Herkenhoff, pela colaboração interinstitucional;

A Dra. Silvia Costa do Laboratório de Controle de Infecções do Hospital das Clínicas, da USP, pelo fornecimento de cepa controle para execução de experimento;

A amiga Luciane Medeiros, que me acompanhou e com otimismo me encorajou para as novas etapas que surgiam;

A André Felipe das Mercês Santos, pelo auxílio na organização das figuras e editoração da dissertação;

Aos professores e amigos do Departamento de Bacteriologia IOC/FIOCRUZ;

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), ao Conselho de Desenvolvimento Cientifico (CNPq) e a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

RESUMO

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ABSTRACT

Nosocomial infections, many times are the main cause of morbity and mortality among hospitalized patients, configuring a serious problem by public health. In this context Pseudomonas aeruiginosa is a leading cause of this kind of infection. At Brazilian hospitals, Pseudomonas aeruginosa , ranked first among all nosocomial pathogens related to pneumonia in intensive care unit, emphasizing its wrapping up with pathologies. The situation is increasingly worst because Pseudomonas aeruginosa is becoming multirresistant, what is a limiting factor in the treatment. Among the antimicrobial agents that are used to treat infections caused by pathogens β-lactam-resistant, the carbapenems are very useful antimicrobial agent due to be stable to hydrolyzing by the most β- lactamases, including extended spectrum β-lactamases (ESBL). However, today is increasingly the number of P. aeruginosa resistant to this agent. Therefore, the aim of this study was evaluate the multirresistance and the factors that were involved at imipenem resistance. A total of 187 strains of Pseudomonas aeruginosa isolated at hospitals of Rio de Janeiro city (3) and Mato Grosso do Sul (1), and isolated in Public Helath laboratories situated at Espírito Santo and Bahia states. The mechanism to carbapenem-resistance was determined using a testing method for screening the production the metallo-β-lactamase (Mbla) using a convenient test using EDTA, and the detection of two genes producing metallo-β-lactamase was verified using PCR. Among all strains, 66.3% were resistant to 6 or more agents. Imipenem resistance was detected in 58.3%, and meropenem in 57.2%, where 85.3% strains was positive to the screening test to Mbla. IMP-1 was detected in 6.7% among the strains what were tested, and SPM-1 were detected in 34.5%. The Pulsed Field Gel Eletrophoresis (PFGE) identified 93 genotypes distinct among the 187 strains analyzed, and was observed the prevalence of one pattern (A), detected at all regions studied. This genotype was positive to the screening test in 96.5% and the SPM-1 gene was detected in 41.4% among the strains with this genotype. This high percentage of multirresistance and the presence of a predominant genotype common at the different regions of the Brazil, indicate the dissemination by resistance genes, representing a problem mainly when isolated at hospital, because the high possibility of an outbreak, impending the ideal treatment.

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LISTA DE TABELAS

Página

Tabela 1 - Espécimes Clínicos analisados de acordo com a origem da amostra 36

Tabela 2 - Distribuição das cepas de Pseudomonas aeruginosa de acordo com o sorogrupo e origem de isolamento

Tabela 3 - Percentual de resistência das cepas de Pseudomonas aeruginosa aos 12 antimicrobianos testados pelo TSA de acordo com a origem de isolamento

Tabela 4 - Perfis de resistência das 187 cepas de Pseudomonas aeruginosa 39

Tabela 5 - Distribuição dos perfis de resistência mais prevalentes de acordo com os sorogrupos

Tabela 6 - Percentual de Pseudomonas aeruginosa resistentes à polimixina B de acordo com a origem de isolamento

Tabela 7 - Distribuição das cepas de Pseudomonas aeruginosa produtoras de metalo- β-lactamase de acordo com a origem de isolamento

Tabela 8 - Freqüência e distribuição das cepas de cepas de Pseudomonas aeruginosa positivas para Mbla pelos testes fenotípico e genotípico

Tabela 9 - Distribuição e freqüência dos perfis genômicos das cepas de Pseudomonas aeruginosa que participaram do estudo de acordo com a origem de isolamento

Tabela 10 - Distribuição dos perfis de PFGE de cepas produtoras de metalo-β- lactamase de acordo com a origem de isolamento, grupo sorológico, perfil de resistência, espécime clínico e tipo de Mbla

Tabela 11 - Perfil genômico e sorogrupo das cepas de Pseudomonas aeruginosa positivas ao teste genotípico de detecção de metalo-β-lactamase

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LISTA DE ABREVIATURAS

AA – Auto aglutinável AMI – Amicacina ATCC – American Type Clture Collection ATM – Aztreonam BA – Bahia CAZ – Ceftazidima CCIH – Comissão de Controle de Infecção Hospitalar CDC – Centers for Disease Control and Prevention CMI – Concentração Mínima Inibitória CIP – Ciprofloxacino CPM – Cefepime DNA – Ácido Desoxirribonucléico EDTA – Ácido etilenodiaminotreacético ES – Espírito Santo ESBL - β-lactamase de espectro estendido GEN – Gentamicina IH – Infecção Hospitalar IMP – Imipenemase IPM – Imipeném LABENT – Laboratório de Enterobactérias LACEN – Laboratório Central de Saúde Publica LPS – Lipopolissacarídeo Mbla – Metalo-β-lactamase MER – Meropeném MS – Mato Grosso do Sul MYSTIC – Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection NA – Não Aglutinável NCCLS – National Comittee for Clinical Laboratory Stndards NNISS – National Nosocomial Infection Surveillance System

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PCIH – Programa Nacional de Controle de Infecções Hospitalares PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) PFGE – pulsed field gel eletrophoresis (gel de eletroforese em campo pulsado) PB – Polimixina B Pb – Pares de base PBPs – Proteínas ligadoras de penicilina SIM – Sulfeto/ Indol/ Mobilidade SPM – São Paulo metalo-β-lactamase TIC – Ticarcilina + Clavulanato TRI – Trato respiratório inferior TRS – Trato respiratório superior TSA – Teste de suscetibilidade a antimicrobianos TZP – Piperacilina + Tazobactam UTI – Unidade de Terapia Intensiva VIM – Verona imipenemase

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3.4.1 Método da Difusão em Discos 21 3.4.2 Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) 3.4.2.1 Realizada através da diluição em Ágar

3.4.2.2 Método da fita de E-teste 23

3.5 Determinação presuntiva da produção de Melo-β-Lactamase (Mbla) – Difusão em duplo disco - Teste fenotípico

3.6 Detecção dos genes IMP-1 e SPM-1, codificadores de metalo-β-lactamases, através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) – Teste genotípico

3.6.1Extração e Quantificação do DNA 25

3.6.2 PCR para IMP-1 26

3.6.3 PCR para SPM-1 27

3.7 Análise dos perfis de fragmentação de DNA cromossomal após tratamento com enzima de restrição e separação pela técnica de Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE)

3.7.1 Preparo do material 28

3.7.2 Extração do DNA cromossomal 28

3.7.3 Eletroforese em Gel de Agarose 29

3.7.4 Análise dos Perfis de DNA Cromossomal 30

IV – Resultados 31

V – Discussão 62

VI – Conclusão 76

VII - Referências Bibliográficas 77

Apêndice 95

I. I NTRODUÇÃO

1.1 A Pseudomonas aeruginosa E A I NFECÇÃO H OSPITALAR

A Infecção Hospitalar constitui um sério problema de saúde pública, principalmente porque contribui para o aumento da taxa de morbidade e mortalidade de pacientes hospitalizados, além de aumentar o tempo de internação destes pacientes e conseqüentemente o custo do tratamento (JARVIS, 1987). Esse tipo de infecção surge durante a hospitalização não estando presente no momento da admissão do paciente ao hospital (BRASIL, 1998). Informações sobre os patógenos envolvidos em casos de infecção hospitalar são importantes, e para tal existem sistemas de vigilância para esta monitorização. Em 1996, o sistema NNIS (National Nosocomial Infections Surveillance), conduzido pelo programa de infecções hospitalares do CDC (Centers for Disease Control and Prevention), nos Estados Unidos descreveu a Pseudomonas aeruginosa como a principal causa de infecção hospitalar dentre todos os patógenos relacionados com a pneumonia em Unidades de Terapia Intensiva (RICHARDS et al. 1999). A P. aeruginosa aparece ainda, como o 4º agente de infecção de sítio cirúrgico, o 5º de infecções hospitalares em geral e o 6º de infecções da corrente sangüínea (NNISS, 1996). No Brasil, segundo SADER e colaboradores (2001), a situação é a mesma, destacando-se nos casos de pneumonias. O sistema de vigilância “Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection” (MYSTIC) monitora a suscetibilidade a carbapenemas e outros antimicrobianos em hospitais (MENDES et al., 2000). Dados obtidos por este sistema mostram que na Europa, a P. aeruginosa foi o 2º agente mais isolado em Unidades de Terapia Intensiva e o 1º em unidades para pacientes com fibrose cística. Na América Latina, o sistema SENTRY – Programa de Vigilância de Resistência

• fornece dados sobre a ocorrência de P. aeruginosa em infecções hospitalares, tendo sido este o microrganismo mais freqüentemente detectado entre os patógenos bacterianos de pacientes com pneumonia internados em 10 centros médicos de seis países da América Latina (SADER et al., 1998).

citocromo-oxidase, utiliza o nitrato em substituição ao oxigênio como aceptor final de elétrons, produzindo também Arginina dehidrolase e Ornitina-descarboxilase.

1.3 ESTRUTURAS ANTIGÊNICAS E FATORES DE VIRULÊNCIA EM P. aeruginosa

A patogenicidade dos bastonetes Gram - negativos não fermentadores depende da aderência a células hospedeiras, produção de polissacarídeos (alginato), toxinas extracelulares, resistência aos fatores bactericidas do soro e presença de lipopolissacarídeo de parede celular (endotoxina). Por ser considerada o mais virulento dessa classe de microrganismos, esses fatores têm sido exaustivamente estudados em P. aeruginosa (ARNOW & FLAHERTY, 1996). As fímbrias ou Pili estendem-se a partir da superfície celular e promovem a aderência da bactéria aos receptores do gangliosídeo GM-1, presentes na superfície das células epiteliais do hospedeiro (IRVIN et al., 1989). A neuraminidase elimina o ácido siálico e resíduos dos receptores de gangliosídeo GM-1, facilitando a ligação das fímbrias. Embora a expressão de pili tenha o papel de mediar a aderência bacteriana e a colonização de superfícies epiteliais, essa estrutura, pode ser prejudicial ao patógeno, pois a aderência direta a receptores na célula fagocítica pode facilitar a morte do microrganismo (KELLY et al., 1989). No entanto, a bactéria apresenta mecanismos regulatórios que limitam a expressão de pili (ISHIMOTO & LORY, 1998). O alginato, polímero de polissacarídeo que confere ao microrganismo uma aparência mucóide (HOIBY, 1975), funciona como mediador de aderência à mucina, além de promover resistência parcial a mecanismos de defesa do sistema imune inibindo a ligação de anticorpos, a fagocitose e a morte intracelular em leucócitos (MAI et al, 1993). Este polímero é produzido quase pela totalidade de cepas que infectam cronicamente pacientes com fibrose cística, e é responsável pelas colônias mucóides observadas em culturas de amostras clínicas obtidas destes pacientes, sendo considerado o principal determinante de patogenicidade para esses pacientes (DERETIC et al., 1994). Diferentemente, amostras isoladas de pacientes com outros quadros clínicos e amostras do meio ambiente raramente revelam produção de alginato (MAI et al., 1993). Entretanto, todas as cepas de P. aeruginosa apresentam o sistema genético que codifica a produção deste tipo de polissacarídeo (DERETIC et al., 1994).

Dentre os fatores de virulência extracelulares, que facilitam o rompimento da integridade epitelial, podem ser citadas as elastases, protease alcalina, fosfolipase C, neuraminidase, exoenzima S, lectina e proteases como hemolisinas e exotoxinas (JAFFAR- BANDJEE et al., 1995). A fosfolipase C destrói a membrana citoplasmática; destrói o surfactante pulmonar, inativa as opsoninas. A exotoxina A inibe a síntese protéica em células eucarióticas, e é produzida pela maioria das cepas de P. aeruginosa isoladas de espécimes clínicos e apresenta potentes efeitos locais e sistêmicos, incluindo necrose de tecidos moles e choque séptico, interrompe a atividade celular e a resposta macrofágica (POLLACK, 1983). A enterotoxina interrompe a atividade gastrintestinal normal, produzindo diarréia. Entre as proteases extracelulares, principalmente a elastase e a protease alcalina, há uma contribuição para a aderência e também para a virulência do microrganismo. Pesquisas com estas enzimas, mostram que em extratos purificados elas causam a necrose de tecidos conectivos por degradarem elastina, laminina e colágeno (HECK et al., 1986). Estas enzimas também apresentam a capacidade de inativar componentes do complemento, clivar IgG e IgA, particularmente em pacientes com fibrose cística (DORING et al., 1984; FICK et al., 1985) e degradar citocinas, incluindo interleucina 2 (IL2), Interferon γ (INF γ) e fator de necrose tumoral (TNFα) (PARMELY et al., 1990). O lipolissacarídeo da parede celular, existente em múltiplos imunotipos, permite a determinação do sorogrupo da bactéria em estudo; é responsável pelas propriedades endotóxicas do microrganismo e a causa da síndrome séptica: febre, choque, oligúria, leucopenia ou leucocitose, coagulação intravascular disseminada, anomalias metabólicas. O biofilme permite a colonização de cateteres vasculares (KOWALEWSKA- GROCHOWSKA, 1991), peritoniais (DASGUPTA & COSTERTON, 1989), urinários (NICKEL, DOWNEY & COSTERTON 1989), tubos nasogástricos (MARRIE, SUNG & COSTERTON, 1990), dispositivos ortopédicos, reservatórios de armazenamento de água em farmácia e/ou laboratório (CRISTINA & COSTERTON 1984).