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EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO NITROGENADA DURANTE A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA DE VINHOS DA CV. TOURIGA NACIONAL DO SUBMÉDIO DO VALE DO SÃO FRANCISCO.
Tipologia: Teses (TCC)
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Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao IF SERTÃO-PE Campus Petrolina Zona Rural, exigido para a obtenção de título de Tecnólogo em Viticultura e Enologia.
O nitrogênio é um dos principais nutrientes demandados para o desenvolvimento de organismos. As leveduras que processam o mosto para transformá-lo em vinho através da fermentação alcoólica, consomem quantidades significativas de nitrogênio assimilável durante a fase exponencial de desenvolvimento, em outras palavras, a carência de nitrogênio ou o baixo suprimento no meio (mosto), afeta a condução da fermentação alcoólica ocasionando fermentações lentas ou mesmo paradas de fermentação, críticas na elaboração dos vinhos. A pesquisa objetivou comparar e descrever os resultados alcançados com a suplementação de nitrogênio ao mosto nas etapas de desenvolvimento das leveduras durante a fermentação alcoólica. Foram avaliados vinhos obtidos pela fermentação de uvas da cv. Touriga Nacional, cultivadas no Submédio do Vale do São Francisco. Para tanto, foram realizadas microvinificações em garrafões de vidro de 20 litros, sendo 4 (quatro) tratamentos e uma testemunha (SN0), com 2 (duas) repetições cada, totalizando 10 (dez) garrafões (microvinificações). Os tratamentos foram suplementados em instantes distintos, sendo: suplementação nitrogenada apenas no início da fermentação alcoólica (SN1); suplementação nitrogenada 48 horas após o início da fermentação alcoólica (SN2); suplementação nitrogenada divida em 2 (duas) etapas, na inoculação das leveduras e 48 horas após início da fermentação alcoólica (SN3); suplementação nitrogenada dividida em 2 (duas) etapas, na inoculação das leveduras e 72 horas após início da fermentação alcoólica (SN4). Durante a fermentação alcoólica, para acompanhamento da cinética fermentativa, os vinhos foram submetidos a cada 12 horas à análise de densidade relativa, além disto, foram realizadas análises de quantificação de nitrogênio assimilável e análises físico- químicas clássicas, para acompanhamento da estabilidade do processo. Passados 6 (seis) meses de engarrafamento, os vinhos foram submetidos a novos ensaios físico-químicos. Por meio do acompanhamento da curva de densidade contatou-se que, os tratamentos SN0 e SN4 apresentaram fermentação mais rápida, chegando a densidades abaixo 1,000 g.L-1^ em até 96 horas após o início da fermentação alcoólica. Com base nos parâmetros de densidade encontrados nos vinhos submetidos ao experimento, indicou-se que a maior disponibilidade de nitrogênio assimilável retardou a conversão de açúcar em álcool, desta maneira, supõe-se que, isoladamente, não existe uma relação positiva entre a disponibilidade de nitrogênio assimilável no mosto e a velocidade com que se processa a fermentação alcoólica. Da mesma maneira é possível afirmar, pela metodologia aplicada, que não houve ganho de rendimento em produção de álcool em função da maior disponibilidade de nitrogênio assimilável, estatisticamente os resultados foram semelhantes, ou seja, maior disponibilidade de nitrogênio assimilável, isoladamente, não é suficiente para elevar a eficiência da taxa de conversão açúcar/álcool.
Palavras-chave: suplementação nitrogenada, fermentação alcoólica, vinhos, Touriga Nacional, Submédio do Vale do Rio São Francisco.
A vitivinicultura brasileira, quando comparada aos principais polos de produção mundial, é relativamente nova e portanto com um grande potencial de produção científica, sobretudo quando associado ao crescente fenômeno global da exploração vitícola em regiões tropicais (TONIETTO & CAMARGO, 2006). Uma das grandes referências da produção tropical é a possibilidade de dois ciclos de produção ou mais por ano (SILVA et al., 2009), isto ocorre graças, entre outros fatores, à maior disponibilidade de sol (temperatura e luminosidade), irrigação controlada, aplicação de fitorreguladores e adoção de manejo de copa, com diferente tipos de podas. Este cenário contrasta com as condições ambientais e práticas adotadas pela vitivinicultura tradicional de regiões com as estações do ano bem definidas (PROTAS et al., 2002). Contudo há outras características que precisam ser consideradas, dentre estas destacam-se as interações entre cultivares, clima e solos no que refere à composição das uvas destinadas para elaboração de vinhos. A composição das uvas afeta consideravelmente o comportamento das leveduras, isto porque os microrganismos são diretamente influenciados pelo meio (LIMA et al., 2001). Condições de estresse ou abundância de nutrientes produzem impactos na microflora, assim como produzem impactos na produção da matéria- prima, mesmo que esta microflora seja introduzida (PIVETTA, 2003; KLUBA et al. 1978). Ou seja, em escala macrobiótica, da mesma forma que a ecologia das videiras é fortemente influenciada pelos fatores bióticos e abióticos de uma região, em escala microbiótica, principalmente por ação de manipulação enológica, podem- se aguardar resultados diferentes para a elaboração de um determinado vinho. Em condições de anaerobiose, o etanol será o principal metabólito das rotas de digestão das leveduras do gênero Saccharomyces. Para tanto, consideram- se duas razões, a primeira diz respeito a principal rota metabólica para obtenção da energia que será utilizada em reações secundárias para o desenvolvimento das
leveduras, a glicólise, na qual as hexoses (glicose e frutose) são metabolizadas por meio de 12 reações para a geração de energia na forma de ATP. O piruvato, molécula de 3 carbonos, resultado final do catabolismo das hexoses, na ausência de oxigênio — por meio da enzima piruvato desidrogenase, que modula a regeneração do NAD+, importante para viabilizar processos metabólicos – será reduzido a álcool etílico (etanol). A segunda diz respeito ao principal substrato, os açúcares de seis carbonos (glicose e frutose), que existem em maior quantidade nas uvas. Durante o desenvolvimento das leveduras, principalmente para desenvolvimento de biomassa (novas células de levedura), outras rotas metabólicas serão demandadas, interferindo desta forma na produção de álcool. Estas rotas metabólicas serão demandadas pela composição química do meio (ácidos orgânicos, compostos nitrogenados, anidrido sulfuroso, oxigênio, etc) e por interferências físicas (temperatura, vibrações, etc) (LIMA et al., 2001). Além dos açúcares fermentescíveis, principal fonte de carbono disponível no mosto de uvas, existem outros constituintes químicos e fatores bioquímicos de importância enológica, não apenas para atribuir o perfil sensorial de um vinho, mas também determinantes para o desenvolvimento das leveduras que atuam no processo de vinificação, influenciando inclusive no comportamento das mesmas quanto à produção de compostos secundários responsáveis pela manutenção destes microrganismos (LIMA et al., 2001). Dentre os compostos de importância enológica, destacam-se os compostos nitrogenados assimiláveis, nutrientes essenciais, responsáveis pela síntese de proteínas e multiplicação das leveduras, tendo importância, inclusive, na estrutura química e sensorial dos vinhos (BISSON 1991; RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). De acordo com Bisson (1991), a quantidade de nitrogênio na uva e no mosto produz impactos na produção da biomassa das leveduras, na velocidade e no tempo de fermentação, e nas substâncias formadas durante o metabolismo das leveduras. Segundo esta autora, a deficiência de nitrogênio no mosto gera como consequência, retardo no inicio da fermentação ou até mesmo a sua parada. Isto
2.1 Exploração Vitícola no Vale do São Francisco
A vitivinicultura do semiárido brasileiro, por suas peculiaridades, pode ser descrita com algo singular, uma vez que está localizada entre os paralelos 8º e 9º S e produz, com escalonamento produtivo, uvas o ano todo totalizando duas safras e meia em condições ambientais adversas como alta luminosidade, temperatura média anual de 26ºC, pluviosidade aproximada de 500mm, a 330m de altitude, em solo pedregoso. Seus vinhos possuem público crescente, porque são jovens “vinhos do sol”, peculiares nos aromas e sabores, considerados como fáceis de beber e apresentando boa relação comercial qualidade/preço (EMBRAPA, 2014). A vitivinicultura comercial no Vale do Submédio São Francisco teve início na década de 1980. As tecnologias Vinícolas tiveram que ao longo do tempo de forma empírica ser adaptadas às condições tropicais desta região. O conhecimento empírico atualmente se soma a progressos científicos que estão sendo adquiridos por meio de investimentos nesta atividade. Entretanto, devido às diferenças, especialmente climáticas, próprias das regiões tropicais, há muito que se conhecer nesta região que é caracterizada como possuidora de um grande potencial de desenvolvimento vitivinícola, mas sem seus limites determinados (TONIETTO & CAMARGO, 2006).
2.2 Touriga Nacional
A Touriga Nacional é considerada uma das castas Portuguesas mais nobres, originária do Dão e do Douro sendo também designada no Dão por Tourigo ou Preto Mortágua. Caracteriza-se por apresentar porte semi-ereto, produtividade média, sendo alta com material vegetativo selecionado. Da origem a vinhos com intensidade de cor elevada (rubi fechado de tonalidade violácea), aroma complexo e intenso a frutos vermelhos (framboesa, cereja), frutos pretos (ameixa), frutos silvestres (amora), compota, passa de uva e floral (rosa, violeta). Possui estrutura e potencial de envelhecimento elevado. (SOUZA et al., 2007; MAGALHÃES, 2008). Esta variedade, nos últimos anos vem ganhando destaque e se consolidando na região do Submédio do Vale do São Francisco pela produção de vinhos de qualidade.
2.3 Composição da uva e do mosto
A videira sofre forte influência do clima, em particular o solo, e das técnicas de condução da planta, além das variações inerentes a cada cultivar. Dentre os elementos do clima, a temperatura apresenta efeito sobre a videira, variando em função das fases do ciclo vegetativo e produtivo da planta (PIVETTA, 2003). Uma baga de uva (Vitis vinifera L.) é formada em geral por 6 a 12% de película 2 a 5% de sementes e 85 a 92% de polpa, variando de acordo com a cultivar (Aquarone et al., 2001; Pato, 1982). A polpa representa a parte majoritária da baga e é constituída por: 65 a 85% de água; 12 a 25% de açúcares; 0,6 a 1,4% de ácidos orgânicos; 0,25 a 0,35% de minerais e; 0,05 a 0,1% de compostos nitrogenados, além de vitaminas A, B1, B2, C e niacina (Aquarone et al., 2001). A
2.4 Compostos Nitrogenados
Conhecer a composição nitrogenada de mostos e vinhos é importante por várias razões, mas principalmente porque os aminoácidos livres são nutrientes para leveduras e bactérias durante a fermentação alcoólica e malolática (KLUBA et al. 1978). A concentração de nitrogênio no mosto varia de acordo com a região, a cultivar, as condições do clima e do solo onde é cultivada a videira, além do uso de fertilizantes (WERMELINGER; KOBLET, 1990; BISSON, 1991; DUTRA et al., 1999). No mesmo sentido, a composição dos aminoácidos é influenciada por diferentes fatores: disponibilidade de água para o transporte destas substâncias, a cultivar, as condições climáticas e a fertilização (SPONHOLZ, 1991). O conteúdo total de nitrogênio no mosto de uvas varia entre 60 e 2. mg.L-1^ (ZOECKLEIN et al., 2001). No vinho, as quantidades de nitrogênio total são menores em relação ao mosto de origem. Esta diminuição, muito significante no primeiro estágio de fermentação, ocorre devido à utilização do nitrogênio pelas leveduras, que o utilizam para sua multiplicação e posterior fermentação (GARCIA; DAUDT, 1988). Os compostos nitrogenados do mosto são importantes para o metabolismo das leveduras. Existe um grande número de compostos contendo nitrogênio, como amônia, aminoácidos, proteínas, vitaminas, aminas e nitratos, que são encontrados nos mostos e nos vinhos. Estes compostos nitrogenados são muito importantes para o crescimento e metabolismo das leveduras durante a fermentação e, em alguns casos, pode ser um fator limitante deste processo (OUGH; AMERINE, 1987). De acordo com Bisson (1991), a quantidade de nitrogênio na uva e no mosto produz impactos na produção da biomassa das leveduras, na velocidade e no tempo de fermentação, e nas substâncias formadas durante o metabolismo das leveduras. Segundo esta autora, a deficiência de nitrogênio no mosto gera como
consequência, retardo no início da fermentação ou até mesmo a sua parada. Isto ocorre porque as leveduras consomem grande parte do nitrogênio disponível antes do término da fase de crescimento durante a vinificação. A busca de padrões operacionais adequados para assegurar a qualidade das bebidas alcoólicas deverá considerar ajustes nos níveis dos nutrientes disponíveis para a levedura, de modo a equilibrar seus efeitos benéficos sobre a viabilidade celular e o metabolismo fermentativo com níveis adequados de compostos secundários da fermentação (DOMINGUEZ, et al., 1997).
2.5 Nitrogênio
O nitrogênio (N) é um macronutriente que desempenha papel importante no desenvolvimento das funções e dos processos biológicos da videira e dos microrganismos. O conteúdo de nitrogênio da uva influencia na composição dos componentes do vinho, exemplo: composição de polifenóis, aminas biogênicas, ésteres, alcoóis superiores, terpenos, entre outros (BELL; HENSCHKE, 2005). A concentração de nitrogênio no mosto varia de acordo com a região, a cultivar, as condições do clima e do solo onde é cultivada a videira, além do uso de fertilizantes (WERMELINGER; KOBLET, 1990; BISSON, 1991; DUTRA et al., 1999). No mesmo sentido, a composição dos aminoácidos é influenciada por diferentes fatores: disponibilidade de água para o transporte destas substâncias, a cultivar, as condições climáticas e a fertilização (SPONHOLZ, 1991). O conteúdo total de nitrogênio no mosto de uvas varia entre 60 e 2. mg.L-1^ (ZOECKLEIN et al., 2001). No vinho, as quantidades de nitrogênio total são menores em relação ao mosto de origem. Esta diminuição, muito significante no primeiro estágio de fermentação, ocorre devido à utilização do nitrogênio pelas leveduras, que o utilizam para sua multiplicação e posterior fermentação (GARCIA; DAUDT, 1988).
químicos, físicos e microbiológicos, cerca de 10% dos açúcares são desviados para formação de produtos diversos do etanol (LIMA et al., 2001). Os produtos da metabolização dos açúcares dependerão das condições ambientais em que as leveduras se encontram. Uma parte dos açúcares será utilizado na síntese de biomassa, modulada por várias rotas metabólicas, afetando a produção de álcool (LIMA et al., 2001). Os compostos nitrogenados do mosto são importantes para o metabolismo das leveduras. Existe um grande número de compostos contendo nitrogênio, como amônia, aminoácidos, proteínas, vitaminas, aminas e nitratos, que são encontrados nos mostos e nos vinhos. Estes compostos nitrogenados são muito importantes para o crescimento e metabolismo das leveduras durante a fermentação e, em alguns casos, pode ser um fator limitante deste processo (OUGH; AMERINE, 1987).
2.7 Fermentação alcoólica
Fermentação alcoólica pode ser definida como a oxidação anaeróbica parcial da glicose, causada pela ação de leveduras, tendo como produto final álcool etílico e gás carbônico, além de outros produtos secundários. (AMORIM, 2005). A transformação de açúcares em álcool é realizada pelas enzimas glicolíticas do citoplasma das leveduras, tais enzimas são moduladas por diversos fatores, cabe destacar: açúcares, compostos nitrogenados, minerais, ph e temperatura (LIMA et al., 2001). Durante a fermentação alcoólica, além da conversão dos açúcares fermentescíveis, é nesta etapa que ocorre a formação da composição química do vinho (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006).
2.7.1 Suplementação nitrogenada
As deficiências de nitrogênio são comumente corrigidas através da adição de fosfato de amônia (27% de NH 4 +^ e 73% PO 4 3-). Nos Estados Unidos, o nível máxi- mo de (NH 4 ) 2 HPO 4 legalmente permitido para corrigir as deficiências nutricionais é de 960 mg.L-1, uma concentração que fornece 203 mg.L-1^ de nitrogênio assimilável. Na Europa, a Organização Internacional da Uva e do Vinho (OIV) só permite que um máximo de 300 mg.L-1^ seja acrescido e na Austrália, as correções são limitadas por níveis máximos de fosfato no vinho, sendo permitida a concentração máxima de 400 mg.L-1^ de fosfato inorgânico.L-1^ (HENSCHKE e JIRANEK , 1993 apud KENNETH e CHARLES, 2007). Em geral, os mostos de uva são considerados deficientes quando apre- sentam concentrações de nitrogênio assimilável entre 140 e 150 mg.L-1^ (KENNETH e CHARLES, 2007). A suplementação de nitrogênio tem um impacto crucial na fermentação al- coólica, influenciando tanto o processo fermentativo como a elaboração de um vinho de qualidade (BISSON, 1999; BELLY et al, 1990). Na elaboração de um vinho, um dos desafios do produtor é otimizar as condições que favorecem o crescimento e desenvolvimento de leveduras fermentati- vas ( Saccharomyces sp. ) e resulte em uma fermentação alcoólica completa, além de evitar a formação de odores indesejáveis no vinho. O ideal é que ao concluir as fer- mentações, alcoólica e malolática, o vinho seja nutricionalmente insuficiente para o desenvolvimento microbiológico (KENNETH e CHARLES, 2007). Desta forma, há um interesse particular na otimização da absorção de nitrogênio pelas leveduras de forma que garanta que todos os compostos nitrogenados presentes no mosto das uvas sejam utilizados de forma completa e eficiente. Cepas de laboratório comum de Saccharomyces cerevisiae podem catabolizar uma variedade de fontes de nitrogênio orgânico de baixa complexidade, tal como a maioria dos aminoácidos e fontes de ni- trogênio inorgânico, como o amônio (COOPER, 1982).
Garcia e Daudt (1988), analisando o conteúdo de nitrogênio total no mosto e no vinho das cultivares Napa Gamay e Flora, verificaram que, no decorrer da fermentação, o nitrogênio total decresceu gradativamente, seguido de um leve aumento no final do processo. Os resultados apresentados estavam de acordo com outros autores e confirmam que, no início da fermentação ocorre consumo de nitrogênio pelas leveduras para se reproduzirem, enquanto que no final do processo fermentativo, o acúmulo de nitrogênio se dá pela autólise das mesmas. O nitrogênio é um elemento essencial aos organismos vivos, sendo que as células de levedura podem utilizar uma ampla variedade de compostos nitrogenados, tais como: amônio, aminoácidos e peptídeos. Nem todas as fontes de nitrogênio propiciam crescimento igualmente eficiente. Foi observado que amônia, glutamato, glutamina e asparagina são preferencialmente utilizadas por leveduras e induzem altas taxas de crescimento. Quando estas fontes primárias estão ausentes ou presentes em baixas concentrações, fontes nitrogenadas alternativas, como outros aminoácidos e peptídeos podem ser utilizadas (TERSCHURE et. al., 2000). O nitrogênio assimilável tem importância intrínseca no crescimento e metabolismo das leveduras na vinificação. Desequilíbrios e, em particular, as deficiências no fornecimento são as causas mais comuns da ocorrência de falhas na fermentação, sendo que é possível conseguir um aumento na quantidade de nitrogênio assimilável, no campo, através práticas vitivinícolas e regimes de adubação controlados. Durante a fermentação, a deficiência de nitrogênio pode ser corrigida pela suplementação com compostos nitrogenados, geralmente sais de amônio (JIRANEK et al., 1995). O setor vitivinícola utiliza como prática corrente a adição de nutrientes (vitaminas e compostos nitrogenados) como forma de correção antes de inocular a levedura alcoólica. Este procedimento elimina o risco de lentidão ou paradas de fermentação, porém, como nem sempre é feita uma análise de nitrogênio antes desta correção, pode causar um aumento desnecessário do teor de nitrogênio,
principalmente em situações onde o teor natural de compostos nitrogenados já está elevado (NOGUEIRA, et al. 2007). A peculiaridade do nitrogênio na uva, em relação aos demais frutos, é que esse nutriente é fundamental para a fermentação do mosto, exigindo concentrações mínimas de 140 mg.L-1^ para que a fermentação ocorra normalmente, sem o risco de parar (KUNKEE, 1991). A Tabela 1 apresenta valores ideias de nitrogênio assimilável em mostos de acordo com seu valor de Sólidos Solúveis Totais (°BRIX).
Quadro 1 - Valores estimados de nitrogênio necessários às leveduras em mostos com diferentes concentrações de açúcar. °Brix Nitrogênio Assimilável (mg.L-1) 21 200 23 250 25 300 27 350 Fonte: Bisson e Butske (2000) apud Kenneth e Charles (2007).
Em geral quando os teores de nitrogênio assimilável ultrapassam 400 mg/L, acarreta um grande risco de desenvolvimento de carbamato de etila, além de aumentar o risco de instabilidade biológica (HIDALGO, 2010).
2.7.2 Cinética fermentativa
Na fermentação alcoólica, os substratos (açúcares) são transformados em produtos (etanol), e parte da energia (ATP) gerada é usada para a produção de biomassa (células). Assim, as concentrações de substrato (açúcar), produto (etanol) e células (levedura) variam com o tempo da fermentação. Hiss (2001) define a variação dessas concentrações como cinética química do sistema.
