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Crescimento Celular de um
Microrganismo e Consumo de um
Nutriente Essencial
- O meio YED (extrato de levedo 1% e glicose 1%) contém todos os nutrientes essenciais (fonte de carbono e energia, fonte de nitrogênio, sais minerais e vitaminas) e mais o microrganismo presente. Consiste em um meio de cultura onde é observado o crescimento celular. - O meio YED era líquido e foi armazenado no erlenmeyer , em um volume de 50 mL. - Fonte de carbono e energia : glicose. 1 g de glicose ---- 100 mL de solução x g de glicose ---- 50 mL de solução - A concentração de glicose no meio YED foi alterada de 2% (roteiro da prática) para 1%. - O meio YED foi preparado pela monitora. Já utilizamos ele pronto. - A prática de crescimento celular tem como objetivo a observação do aumento de massa ( método indireto ) ou da elevação do número de células ( método direto ) de um determinado microrganismo ( Saccharomyces cerevisiae ) ao longo do tempo. - Isso ocorre em um meio de cultura (YED) à temperatura e pH adequados, condições de assepsia, grau de aeração x = 0,5 g de glicose em 50 mL de solução
conveniente, presença do microrganismo e de nutrientes essenciais.
- Outro objetivo da prática é a checagem do desaparecimento de um nutriente essencial ( fonte de carbono ) conforme o crescimento celular se processa. Isso acontece porque a fonte de carbono, que é a glicose , é consumida pelos microrganismos na via glicolítica. Esta via gera ATP, NADH e intermediários piruvato , sendo estes últimos essenciais para a fermentação alcoólica. - A fonte de carbono ( glicose ) atua como matriz energética para a divisão celular , através da geração de ATP. Essa divisão celular leva ao aumento de massa de microrganismos no meio de cultura. - Caso tenhamos de preparar o meio de cultura YED, serão informadas as porcentagens (m/v %) de glicose e de extrato de levedo. Na mesma solução, teremos x % de glicose e y % de extrato de levedo. O volume de z mL para a solução também deve ser relatado. x % de glicose → x g de glicose em 100 mL de solução (Logo, em z mL de solução, quantos gramas de glicose haverá?) y % de extrato de levedo → y g de extrato em 100 mL de solução (Logo, em z mL de solução, quantos gramas de extrato de levedo haverá?) - Basta aplicar a regra de 3 para encontrar as massas adequadas. - Utilizar um balão volumétrico para o preparo da solução. - As leveduras Saccharomyces cerevisiae realizam a fermentação alcoólica como extensão da via glicolítica. A
- O fator K corresponde ao coeficiente angular da reta. Logo, K = cateto oposto/cateto adjacente = Abs/[células]. Se Abs é adimensional e [células] está em mg/mL , então K tem unidade (mg/mL)-^1. - Conversão de mol/L para mg/mL: Ex.: solução de NaOH 2,5 mol/L (ou M) Massa molar de NaOH: 40 g/mol 1 mol de NaOH ---- 40 g ---- 1 L 1 mol de NaOH ---- 40 .000 mg ---- 1 L 2,5 mol de NaOH ---- x mg ---- 1 L 1 L = 1000 mL 100 .000 mg de NaOH ---- 1000 mL y mg de NaOH ---- 1 mL Concentração: 100 mg/mL de NaOH Para converter mg/mL → g/L, basta utilizar a seguinte relação: 100 mg = 0,1 g 0,1 g ---- 1 mL z g ---- 1000 mL (1L) Concentração: 100 g/L de NaOH - O tempo de geração ( Tg ) consiste no período necessário para que a quantidade total de células no meio de cultura seja duplicada. x = 100.000 mg de NaOH em 2,5 mol y = 100 mg de NaOH em 1 mL z = 100 g de NaOH em 1 000 mL
- O tempo de geração Tg está associado à fase LOG (fase exponencial) do crescimento celular. - A quantidade total de células pode ser expressa em massa, número de células ou concentração de células em solução. Metodologia: 1) As células de leveduras já estavam crescendo desde a manhã, antes de as aulas práticas iniciarem. Foram monitoradas as [células] ao longo do tempo (de 1 em 1 hora). Yasmin e a professora Márcia realizaram essa etapa para cada um dos frascos. Horário [células] 10:30 ------ 0,33 mg/mL 11:30 ------ 0,44 mg/mL 12:30 ------ 0,75 mg/mL x mg de células ------ 1 mL de solução - Esses valores em mg/mL foram obtidos após a multiplicação de Abs/K pelo fator de diluição e conversão da concentração para mg/mL. O resultado de Abs/K é sempre dado, inicialmente, em mM porque K possui unidade (mM) - 1 e Abs é adimensional. 2) Para a avaliação posterior da concentração inicial de glicose : retirar uma alíquota de 1 mL de suspensão celular em meio YED (Erlenmeyer) e colocar em um tubo Falcon de 15 mL. Adicionar 4 mL de água destilada. Homogeneizar e centrifugar a 3000 rpm por 5 min. - Fazer esta etapa somente se a concentração inicial de glicose não for informada no roteiro. As Abs não foram fornecidas!
2 3 14:11 h 1 mL 4 mL 3 4 14:40 h 1 mL 9 mL
- Volumes totais após a diluição da suspensão celular: 2 + 1 = 3 mL (tubo 1); 2 + 1 = 3 mL (tubo 2); 4 + 1 = 5 mL (tubo 3); 9 + 1 = 10 mL (tubo 4). - Tubos 1 e 2: volume de suspensão celular diluído 3x; tubo 3: volume de suspensão celular diluído 5 x; tubo 4: volume de suspensão celular diluído 10 x. - Os diferentes horários ( 30 em 30 min ) servem para checar os estágios do crescimento celular. - O Erlenmeyer contendo a suspensão celular em meio YED foi mantido o tempo inteiro em outro laboratório, em refrigeração e sob agitação constante. A turma se deslocou até lá para a retirada das alíquotas indicadas acima. 4) Após a diluição da suspensão celular nos tubos Falcon , estes foram homogeneizados e colocados na geladeira até as análises de Abs. Nesta etapa, não há centrifugação porque não precisamos do sobrenadante. 5) Retirada dos tubos da geladeira para as análises de Abs de meios de cultura dos tubos 1 , 2 , 3 e 4. - Como as alíquotas de 1 mL de suspensão celular (mesmo meio) foram diluídas em maiores volumes de água no tubo Falcon ( 3x , 5x e 10x ), os valores de Abs tendem a diminuir porque a turbidez é reduzida. É normal. - As diluições de um mesmo volume de alíquota de suspensão inicial (retirado em tempos diferentes) em vários volumes de água servem para não haver a imprecisão de leitura no
espectrofotômetro. Uma vez que a concentração de células tende a aumentar no decorrer do tempo, são necessários maiores volumes de água destilada. A turbidez não pode ser tão grande a ponto de dificultar o espalhamento e transmissão de luz, que são exatamente as técnicas do espectrofotômetro para fornecer os valores de Abs.
- O DNS não é utilizado aqui porque não faremos ainda a investigação do teor de glicose. - Como eu e Camila utilizamos o espectrofotômetro J para a curva de peso seco, ele será novamente utilizado para avaliar o crescimento celular. - Branco da análise: somente água destilada. - Leitura: ajustar o λ em 570 nm. Zerar o equipamento. Em seguida, higienizar a cubeta e adicionar água destilada para a leitura. Quando aparecer um valor no leitor, zerar de novo. As próximas medidas devem ser feitas sequencialmente com as amostras, sem a necessidade de zerar o aparelho. Tubo Abs (570 nm) Diluição [células] (mg/mL) 1 3x 2 3x 3 5x 4 10x Fator (K) da curva de peso seco (espectrofotômetro J): 2,2426 (mg/mL) - 1 [células] = Abs/K → Unidade de [células] = mg/mL
- Para o branco da análise de Abs : colocar, em um tubo de ensaio , 1 mL de água + 1 mL de DNS → homogeneizar → ferver a 100°C por 5 min → esfriar → adicionar 13 mL de água destilada → homogeneizar novamente → armazenar o tubo na bancada. 8) Ajustar o espectrofotômetro F para λ = 540 nm (comprimento de onda para açúcares redutores). Zerar o equipamento. Em seguida, higienizar a cubeta e adicionar o branco (DNS + água) para a leitura. Quando aparecer um valor no leitor, zerar de novo. As próximas medidas devem ser feitas sequencialmente com as amostras, sem a necessidade de zerar o aparelho. - Será feita somente uma leitura de Abs para glicose inicial e uma leitura de Abs para a glicose final. Se a [glicose] inicial foi dada no roteiro, analisar somente a Abs da suspensão final. [glicose inicial] (mM): [glicose final] (mM): Abs: Abs: - Lembre-se de que [glicose] = Abs/K → dado em mM , inicialmente. K ( coeficiente angular da curva padrão de dosagem de glicídeos ): 0,0935 (mM) - 1 . - Deve-se multiplicar cada [glicose] ( inicial e final ), em mM, pelo fator de diluição (5), a fim de determinar as concentrações verdadeiras: Inicial: Final:
Obtidos os valores, basta considerar que: 1 mol ---- 180 g de glicose ---- 1 L de solução 1 milimol ---- 180 mg de glicose ---- 1 L de solução Para cada valor de [glicose] (inicial e final), fazer a seguintes regras de 3 para descobrir as massas de glicose (em mg) nas soluções inicial e final: 1 mM ---- 180 mg de glicose x mM ---- y mg de glicose Glicose inicial: Glicose final: A diferença de massa de glicose nas soluções inicial e final corresponde à quantidade (em mg) de glicose consumida pelas leveduras durante a fermentação alcoólica. mg de glicose (inicial) – mg de glicose (final) = Para calcular as concentrações, em mg/mL, de glicose final e inicial, basta considerar as seguintes informações: 1 mol/L (molar) ---- 180 g de glicose 1 milimol/L (milimolar) ---- 180 mg de glicose y mg de glicose ---- 1 000 mL z mg de glicose ---- 50 mL
- Os cálculos para mg/mL x fator de diluição foram feitos à mão. - O gráfico plotado é do tipo t x (mg/mL x fator de diluição). O tempo (em horas e minutos, exatamente como está na tabela) corresponde ao eixo x ; a (concentração x fator de diluição) corresponde ao eixo y.
- A região de aumento exponencial da curva corresponde à fase LOG do crescimento celular. Nesta etapa, há divisão celular conforme o consumo de glicose se processa. A velocidade de crescimento celular depende da interação do microrganismo com o meio de cultura e condições experimentais. - Durante a fase LOG , a divisão celular ocorre em taxas constantes e intervalos de tempo regulares (Tg). 10) Cálculo do tempo de geração (Tg): Deve-se escolher dois pontos do gráfico acima para a utilização da equação a seguir. Selecionar pontos em que uma concentração seja praticamente o dobro da outra, pois esse é o conceito de tempo de geração. y = e - 0 ,036x R^2 = 0,
e não a concentração real de uma determinada substância no meio original (Erlenmeyer). Para obtermos essa concentração real, é preciso multiplicar Abs/K pelos fatores de diluição.
