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Estrutura de Tópicos do Módulo de Cancerologia Módulo/especialidade: CLÍNICA CIRÚRGICA II / ONCOLOGIA Professor: Marcos Venício Alves Lima
AULAS DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR – PARTES I E II
Biologia Celular e Molecular do Câncer Câncer: Câncer é uma doença caracterizada pela multiplicação e propagação descontroladas no corpo de formas anormais das próprias células
A- O GENOMA : o genoma de um organismo é toda a informação hereditária do organismo que está codificada no seu DNA (ou, em alguns vírus, no RNA). Isto inclui tanto os genes como as seqüências não-codificadoras (conhecidas como DNA- lixo, ou junk DNA). O termo foi criado, em 1920, por Hans Winkler, professor de Botânica na Universidade de Hamburgo. É o conjunto formado por apenas um cromossomo de cada tipo, na espécie estudada. No ser humano o genoma é constituído de 23 cromossomos diferentes. Depois de propor o modelo da estrutura tridimensional do DNA e sabendo que esta era a molécula da hereditariedade da célula, Francis Crick e James Watson propuseram que a seqüência de nucleotídeos da molécula provavelmente funcionava como um código, capaz de direcionar a síntese de proteínas. Crick propôs o “Dogma Central”, em que a informação genética "fluía" do DNA para a proteína através de uma molécula carreadora, o ácido ribonucléico – RNA (molécula fita simples, formada por nucleotídeos que contém em um esqueleto de açúcar-fosfato, ribose ao invés de desoxirribose e uracila no lugar da timina). A informação contida no DNA seria primeiro traduzida em RNA e depois transcrita em proteínas.
- Estrutura do DNA DNA é formado por um arranjo linear de unidades semelhantes que se repetem, chamadas nucleotídeos, e se compõem de açúcar, fosfato e uma base nitrogenada.
- Bases Nitrogenadas: ADENINA, TIMINA, GUANINA, CITOSINA. Purinas (2 anéis) – Adenina e Guanina Pirimidinas (1 anel) – Timina (Uracila no RNA) e Citosina Complementariedade entre as bases: Adenina estabelece duas ligações de hidrogênio com Timina Citosina estabelece três ligações de hidrogênio com Guanina
- Seqüência nucleotídea: A ordem particular em que as bases se alinham ao longo da cadeia de açúcar e fosfato é chamada a seqüência nucleotídica do DNA.
- Ligações (pontes) nitrogenadas: O que estabiliza a estrutura em hélice?
- ligações covalentes que formam cada fita
- interações hidrofóbicas entre as bases
- ligações de hidrogênio entre as bases
- Forças de Van der Walls devido ao empilhamento das bases
- Interação de cátions com esqueleto açúcar fosfato
A instrução para que as células fabriquem uma proteína específica é dada por um segmento da cadeia de DNA contendo uma seqüência específica de bases. Gene é um segmento de DNA que contém a mensagem completa para a síntese de uma proteína.
B- A SÍNTESE PROTÉICA: Processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na seqüência de nucleotídeos de uma molécula de DNA fita dupla. A transcrição representa a diversidade e a complexidade da expressão dos genes contidos em um determinado genoma. Enquanto a síntese de DNA deve ser precisa e uniforme, a transcrição reflete o estado fisiológico da célula e, portanto, é extremamente variável para atender às suas necessidades. Apenas uma das fitas do DNA é utilizada como molde, portanto, a molécula de RNA sintetizada é complementar à fita de DNA que lhe deu origem e idêntica à outra fita de DNA, sendo as timinas substituídas por uracilas.
- Códons e Aminoácidos: O grupo de Gobind Khorana e Marshall Nirenberg finalmente decifrou o código genético. Eles descobriram como a linguagem dos nucleotídeos do RNAm era traduzida na linguagem de aminoácidos das proteínas. Os dados obtidos por Crick e outros cientistas mostraram que um grupo de três nucleotídeos formavam um códon. Isso, teoricamente, fazia sentido, pois um códon feito de um ou dois nucleotídeos não poderia produzir combinações suficientes para codificar todos os 20 aminoácidos conhecidos (ex.: 1 nucleotídeo = 4 códons possíveis; 2 nucleotídeos = 4 x 4 códons possíveis; 3 nucleotídeos = 4 x 4 x 4 códons possíveis.). Mas um códon feito de três nucleotídeos produz 64 combinações. Isso produziria um código redundante, ou degenerado, onde muitos códons diferentes especificariam o mesmo aminoácido. Pelo princípio da parsimônia – na qual a solução mais simples geralmente é a correta – excluiu a hipótese do códon formado por quatro nucleotídeos Em 1961, Heinrich Matthaei e Nirenberg começaram os experimentos para testar a hipótese do códon triplo. Foi usado um extrato de uma célula qualquer de E.coli , pois eles acreditavam que esse extrato poderia conter todos os componentes necessários para traduzir RNAm em proteínas. O extrato foi tratado com DNase para destruir qualquer resto de DNA da E.coli – com isso não haveria o molde a partir do qual o RNAm seria produzido. Assim, o DNA é tanscrito numa molécula de RNAm complementar que, no citoplasma, se associa ao ribossomo. O código do RNAm é então traduzido numa cadeia polipeptídica, fenômeno denominado translação. O códon AUG inicia a tradução. Um RNAt ativado carrega o primeiro aminoácido - metionina
- para o ribossomo. O anticódon do RNAt liga-se ao códon AUG no RNAm. Como os dois RNAs são mantidos em posição, uma ligação peptídica é formada entre os aminoácidos. O segundo RNAt recebe a cadeia de proteína em crescimento e a metionina do primeiro RNAt é cedida. O processo vai se
Em biologia, transdução de sinal refere-se a qualquer processo através do qual uma célula converte um tipo de sinal (físico ou químico) ou estímulo em outro. A maioria dos processos de transdução de sinal envolvem sequências ordenadas de reacções bioquímicas dentro da célula, que são levadas a cabo por enzimas activadas por mensageiros secundários, resultando numa via de transdução de sinal. Tais processos são usualmente rápidos, levando cerca de milisegundos a realizarem-se, no caso do fluxo de íons, ou minutos para a activação de cascatas de quinases mediadas por proteínas e lípidos, mas podem durar horas, e mesmo dias, a completar. O número de proteínas e outras moléculas participantes nos eventos envolvendo transdução de sinal aumenta à medida que o processo emana do estímulo inicial, resultando numa cascata de sinal, começando com um relativo pequeno estímulo que desenvolve uma grande resposta. Isto é referido como amplificação de sinal.
2. Características dos sistemas de transdução de sinais: especificidade e seletividade e amplificação do Sinal 3. Mensageiros secundários: Moléculas intracelulares sinalizadoras cuja concentração aumenta ou diminui em resposta a associação de um ligante a um receptor na superfície da célula. Exemplos: cAMP (AMP cíclico), cGMP (GMP cíclico), Cálcio (Ca2+), IP3 (Inositol trisfosfato), NO (óxido nítrico). 4. Receptores que possuem atividade enzimática intrinsica Tirosina quinases: receptores de PDGF, insulina, EGF, FGF Tirosina fosfatases: receptor CD Serina/treonina quinases: receptor de TGF-beta Guanilato ciclases: receptores de peptídeos natriuréticos 5. Transcrição protéica e fatores de crescimento
Os componentes mais importantes das vias de sinalização nas células em proliferação consistem nas tirosinas quinases receptoras ou quinase ligada a receptores ou quinases ativadas por mitógenos.
D - PROLIFERAÇÃO CELULAR: A proliferação celular está envolvida em numerosos processos fisiológicos e patológicos, incluindo crescimento, cicatrização, reparo, hipertrofia hiperplasia e desenvolvimento de tumores. É necessária a angiogênese durante a ocorrência de vários desses processos.
a- Ciclo Celular.
Chama-se ciclo celular ao conjunto de processos que se passam numa célula viva entre duas divisões celulares. O ciclo celular consiste na interfase e na fase mitótica, que inclui a mitose e a divisão celular (citocinese). interfase corresponde ao período entre o final de uma divisão celular e o início da segunda. Geralmente a célula encontra-se nesta fase maior parte da sua vida. Durante esta fase o DNA não é visível ao Microscópio óptico. A Interfase divide-se em 3 fases: Fase G 1 o Nesta fase sintetizam-se muitas proteínas, enzimas e RNA, verifica-se também a formação de organitos celulares e, consequentemente, a célula cresce. Fase S o É nesta fase que ocorre a auto-replicação das moléculas de DNA (diz-se no plural porque para cada cromossomo existe uma molécula de DNA) o A partir deste momento os cromossomos passam a possuir dois cromatídeos ligados por um centrómero. Fase G 2 o Neste período dá-se a sintese de moléculas necessárias à divisão celular (como os centríolos). Fase mitótica Como já foi dito a fase mitótica divide-se em duas fases: a Mitose (ou cariocinese) e a Citocinese. Mitose Nesta fase ocorre a divisão nuclear (nas células eucarióticas). É um processo contínuo, no entanto distinguem-se 4 fases: Prófase o É a etapa mais longa da mitose; o Os filamentos de cromatina enrolam-se, tornando-se cada vez mais curtos, possibilitando assim o seu visionamento no Microscópio óptico; o Os dois pares de centríolos afastam-se em sentidos opostos, entre eles forma-se o fuso acromático (sistema de microtúbulos proteícos que se agrupam e formam fibrilas); o Quando os centríolos alcançam os pólos da célula o Invólucro nuclear quebra e os nucléolos desaparecem. Metáfase o Os cromossomas atingem a máxima condensação; o O fuso acromático completa o desenvolvimento e algumas fibrilas ligam- se aos centrómeros (as outras ligam os dois centríolos); o Os cromossomas encontram-se alinhados no plano equatorial (plano equidistante dos dois pólos da células) constituindo a Placa equatorial. Anáfase o As fibrilas encurtam-se e começam a afastar-se; o Dá-se a clivagem dos centrômeros. Os cromatídios que antes pertenciam ao mesmo cromossoma, agora separados, constituem dois cromossomas independentes. Telófase o A membrana nuclear forma-se à volta dos cromossomas de cada pólo da célula, passando a existir assim dois núcleos com informação genética igual; o Os núcléolos aparecem; o O fuso mitótico dissolve-se;
marca proteínas indesejadas (por exemplo proteínas mal-dobradas) para que sejam degradadas por organelas chamadas proteassomas. Embora relativamente recentes, estudos mostram que a degradação pelo sistema ubiquitina-proteassoma parece afetar praticamente todos os processos celulares. A sinalização por ubiquitina e suas cadeias tem um papel não proteolítico no transporte pela membrana, na estrutura e transcrição da cromatina, na reparação de DNA e diversas outras vias sinalizadoras. O complexo APC regula as proteínas inibidoras do início da anáfase. O APC ativado promove a degradação das proteínas inibidoras da anáfase e a ubiquitinação de outros substratos. A destruição das ciclinas mitóticas permite a progressão do ciclo celular, em direção ao final da mitose.
Características da Fase G
- Baixa concentração de ciclina D
- Proteína Rb hipofosforilada: A proteína Rb hipofosforilada mantém o ciclo celular no ponto de controle ao inibir a expressão de várias proteínas essenciais para a progressão do ciclo. A proteína Rb desempenha sua função através da ligação aos fatores de transcrição E2F, que controla a expressão dos genes que codificam as ciclinas E e A, a DNA polimerase, a timidina quinase, a diidrofolato redutase, todas essenciais na fase S.
Controle Molecular da Mitose
Ponto de checagem de fuso mitótico: É um complexo de proteínas citoplasmáticas necessárias para garantir a correta segregação cromossômica durante divisão celular. Atuam como um “controle de qualidade” do ciclo celular (descrito pela primeira vez em 1991); As principais proteínas envolvidas no ponto de checagem são:
- MAD2 (= “mitotic arrest deficient”), codificada pelo gene de mesmo nome localizado no cromossomo 4q27²; - BUB1 (=“budding uninhibited by benzimidazole”) codificada pelo gene de mesmo nome localizado no cromossomo 2q12-143. O ponto de checagem do fuso detecta a presença de até um único microtúbulo que não esteja ligado ao cinetócoro correspondente e atrasa a progressão do processo de divisão celular até que esse cinetócoro capture o microtúbulo do pólo oposto do fuso.
E- MORTE CELULAR
Telomerase é uma enzima descoberta por Elizabeth Helen Blackburn e Carol Greider, que tem como função adicionar sequências específicas e repetitivas de DNA à extremidade 3' dos cromossomas, onde se encontra o telômero. Esta enzima é uma transcriptase reversa, tendo na sua estrutura um modelo em RNA que utiliza para sintetizar o DNA telomérico, em eucariotas. Funções da telomerase:
- Protege o DNA da perda dos genes finais
- Degradação
- Rearranjo
- Fusão
- A cada ciclo há perda de uma porção telomérica
- A telomerase estabiliza os telômeros
- Expressa em células proliferantes: As células germinativas, as células-tronco e as células proliferantes do TGI, medula óssea e 95% dos tumores avançados expressam essa enzima. Nesse último caso foi sugerido que essa enzima confere imortalidade a essas células.
Apoptose: A apoptose refere-se à ativação de um mecanismo autodestrutivo interno, com uma seqüência de eventos bioquímicos geneticamente programada. Diariamente remove 10 bilhões de células do corpo adulto. Os principais fatores atuantes são as caspases (efetuam proteólise seletiva)
a- Vias de apoptose
• Via mitocondrial (mediada pela caspase 9)
Fatores internos Lesão DNA (p53) Ausência de fatores de sobrevivência
• Via dos receptores da morte (mediada pela caspase 8)
TNF
b- Fatores de sobrevivência
- Citocinas
- Hormônios
- Fatores de contato intercelular
F- MUTAÇÕES
Definição : Uma mutação é uma modificação casual ou induzida na informação genética. A mutação só é passada para os descendentes de organismos complexos se ocorrer em gâmetas.
Tipos de mutações
- Pontual : ocorre substituição de um único nucleotídeo, alterando apenas um códon particular. As mutações onde a troca não altera o aminoácido codificado são chamadas de neutra (CGU e CGA ambos codificam arginina). Se houver mudança é chamada de mutação com troca de sentido ou missense. Existem as mutações sem sentido (nonsense), isto é, quando a troca nucleotídea resulta em um códon finalizador (UAA, UAG e UGA) não sendo produzida a cadeia polipeptídica completa. Tipos de mutações potuais:
- Neutras
- Com troca de sentido ( missense )
- Sem sentido ( nonsense ) 2. Cromossômica: A mutação cromossômica é o processo de mudança que resulta em partes rearranjadas do cromossomo, números anormais de cromossomos individuais, ou números anormais de conjuntos cromossômicos. Como na mutação gênica, o termo mutação cromossômica é aplicado tanto ao processo quanto ao produto, de modo que os novos arranjos genômicos podem ser
interiorizados, são expressos na membrana, em conjunto com moléculas classe II do complexo de histocompatibilidade maior (MHC). Os linfócitos capazes de reconhecer esta configuração (Ag + MHC classe II) pertencem à classe de linfócitos auxiliares (helper), e caracterizam-se pela presença da molécula CD4 em sua membrana. Uma vez efetuado o reconhecimento do antígeno, esta classe de linfócitos CD4+ ativa-se, prolifera e secreta uma série de citocinas que são capazes de ativar outras populações celulares. Os linfócitos T citotóxicos (CD8) são capazes de reconhecer antígenos expressos nas células tumorais em conjunto com moléculas da classe I do MHC, mas, para tornarem-se ativados e exercerem citotoxicidade, necessitam de citocinas produzidas pelos linfócitos auxiliares (CD4). Para isto, é necessário que os antígenos tumorais sejam processados por células apresentadoras de antígenos e apresentados em conjunto com moléculas da classe II do MHC.
G- CLASSIFICAÇÃO DOS GENES
Classes de genes associadas ao desenvolvimento do câncer
- Oncogenes
- Genes supressores
- Genes de reparo do DNA
- Oncogenes
Protooncogene: Os protooncogenes codificam proteínas que são importantes para a regulação do crescimento e proliferação celular em condições
normais. Por exemplo, o protooncogene c-sis codifica para o fator de crescimento PDGF. Células que contêm c-sis ou então v-sis (c para celular e v para viral) mutado (denominado oncogene ativado) produzem altos níveis de PDGF, que se liga aos receptores de PDGF na superfície das células resultando numa constante estimulação para proliferação celular.
Oncogene ativado: Da mesma maneira, o protooncogene ras codifica proteínas que ligam GTP, ou proteínas G. Durante a transdução de sinal, a proteína G liga GTP e é ativada, sendo desativada pela clivagem de GTP a GDP, resultando no término do sinal estimulatório. Formas mutadas de proteínas codificadas pelo protooncogene ras são capazes de ligar GTP com eficiência, mas incapazes de quebrar essa molécula. Portanto, células contendo essa proteína mutada estão constantemente recebendo sinais estimulatórios, resultando numa proliferação descontrolada. Mecanismos de ativação: Incorporação ao genoma viral Mutações
Protooncogene Tumor
abI leucemia mielóide crônica
erbB-1 carcinoma de célula escamosa; astrocitoma
erbB-2 (Neu) adenocarcinoma de mama, ovário e estômago
- Genes supressores: Além dos proto-oncogenes, outro tipo de gene está envolvido no aparecimento e desenvolvimento de certos tipos de câncer. Esses genes, chamados de genes supressores de tumor, ou antioncogenes, atuam de maneira diferente dos oncogenes. As proteínas codificadas pelos genes supressores de tumor estão envolvidas na repressão do crescimento e divisão celular. Portanto, perda ou mutação nos antioncogenes pode levar ao crescimento descontrolado devido à remoção dos mecanismos que regulariam a divisão de maneira inibitória.
Gene supressor de tumor Tumor
RB retinoblastoma; osteosarcoma; carcinoma de mama e pulmão
p astrocitoma; carcinoma de mama, cólon, pulmão e tireóide; osteosarcoma
WT1 tumor de Wilms
DCC carcinoma de cólon
NF1 neurofibroma tipo 1
FAP carcinoma de cólon
MEN- tumores de paratireóide, pâncreas, hipófise e córtex adrenal
- Genes de reparo do DNA MECANISMOS DE REPARO
acordo com a orientação fornecida pela fita complementar não-danificada, que contém uma guanina. Finalmente, a integridade da fita corrigida é restaurada pela DNA-ligase. Existem outras glicosilases que reconhecem e removem hipoxantina, 3-metil-adenina e purinas com anel imidazol aberto por radiação ionizante ou pH elevado.
Reparo por excisão de nucleotídeos (REN) Ocorre quando a remoção da base defeituosa é feita pela incisão endonucleolítica nos dois lados da lesão, com liberação dos nucleotídeos, seguida pelo preenchimento da região por ação da DNA-polimerase. Em todos os organismos onde já foi estudado, o processo de REN consiste em cinco etapas:
- Reconhecimento da lesão por um complexo multienzimático;
- Incisão da fita anormal em ambos os lados da lesão a alguma distância desta;
- Excisão do segmento contendo a lesão;
- Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde, por ação da DNA-polimerase;
- Ligação/restauração da molécula de DNA por ação da enzima DNA-ligase. A extensão média do fragmento de DNA removido é de 12 nucleotídeos, razão pela qual esse modelo é chamado de reparação de regiões curtas. Em caso de grandes quantidades de lesões, em que a substituição envolve de 1500 a 9000 nucleotídeos, o modelo é conhecido como reparação de regiões longas. A diferença entre esses dois modelos de reparação é que o primeiro é uma função constitutiva da célula, enquanto o segundo deve ser induzido por lesões no DNA – pelo menos no que diz respeito à célula bacteriana.
Reparo de bases malpareadas Algumas bases incorretamente pareadas conseguem escapar da revisão realizada pela DNA-polimerase durante o processo de replicação. Por isso, na E. coli , a etapa final que confere precisão ao processo de replicação é de responsabilidade do sistema de correção de erro, que consiste em várias proteínas codificadas pelos genes mut. Esse sistema percorre o DNA recentemente sintetizado à procura de pares de base malpareadas e remove os segmentos de fita simples contendo nucleotídeos incorretos. Isso permite que a DNA-polimerase insira a base correta na lacuna formada. A dificuldade que surge, aparentemente, é a de distinguir qual das bases de um par erroneamente formado é a incorreta, porque ambas são componentes naturais do DNA. Se a remoção de uma das bases fosse ao acaso, haveria a probabilidade de 50% de a base correta ser removida e a mutação poderia ser perpetuada, ao invés de ser corrigida. Existe, porém, um sinal específico que direciona o sistema de excisão do erro exclusivamente para a fita recém-sintetizada: o reconhecimento de seqüências GATC próximas ao erro. GATC metiladas indicam a fita parental, enquanto que ausência de metilação nestas seqüências caracteriza a fita recém-sintetizada. O sistema de correção detecta não somente pares únicos de bases malpareadas, mas também adições e deleções, o que reduz a incidência de mutações por modificação no módulo de leitura, além daquelas envolvendo substituição de bases.
Reparo por recombinação No processo de reparação por recombinação, a fita complementar não danificada é utilizada como molde na substituição do fragmento lesado. Algumas vezes, porém, esse molde não está disponível, por motivos diversos. A DNApolimerase, então, é
forçada a passar pela lesão sem replicar aquela região. Uma lacuna com um tamanho considerável é deixada na fita recém-sintetizada. Toda a informação do sítio danificado é perdida e somente pode ser recuperada pela utilização de outra molécula idêntica de DNA. Como as células de organismos superiores são geralmente diplóides, elas possuem a mesma seqüência, ou praticamente a mesma, em cada um dos cromossomos homólogos. Uma fonte apropriada de DNA, portanto, pode ser encontrada na célula. Assim, como esquematizado na figura abaixo, após uma mutação, a fita 1 do homólogo A (1A) não está disponível; a fita 2 do homólogo A (2A) possui uma lacuna. As fitas 1 e 2 do homólogo A’ (1A’ e 2A’, respectivamente) estão íntegras. No reparo por recombinação, a fita 1A’ é permutada pela fita 2A, de modo que 1A’ sirva de molde para reconstrução de 1A; e 2A’ sirva de molde para 2A. Na E. coli , é de fundamental importância a proteína RecA , pois só ela é capaz de parear duas moléculas de DNA homólogas e catalisar as reações de trocas de fitas, permitindo reparação e recuperação de lesões.
Reparo através do sistema SOS Uma vez que a célula pode regular a expressão gênica de acordo com sua necessidade, muitas enzimas envolvidas no reparo do DNA são induzidas pelo próprio defeito da molécula de DNA. As enzimas mais importantes desse processo são derivadas dos genes SOS, cuja expressão é induzida por um defeito severo o bastante a ponto de impedir a síntese de DNA. Estes genes dão origem a proteínas de reparo como, por exemplo, endonucleases de excisão, helicases, entre outras. Os dímeros de pirimidinas constituem um exemplo típico desse tipo de dano. Quando a forquilha de replicação encontra um dímero, a síntese pára e só é reiniciada a alguma distância além do dímero, ficando uma lacuna no DNA na qual a enzima de recombinação RecA se liga. Essa ligação ativa em RecA uma atividade enzimática completamente independente da recombinação: ela destrói o repressor dos genes SOS (repressor LexA). Dessa maneira, a proteína RecA promove reparação do material genético de duas formas: por recombinação, com troca das fitas, e por indução dos genes SOS.
