“Sequenciamento enzimático de Sanger envolve reações de polimerização do DNA e
terminação de cadeia por didesoxirribonucleotídeos
O método de sequenciamento mais usado até o momento foi desenvolvido por Frederick
Sanger. Assim como a tecnologia do DNA recombinante e a PCR, tal técnica também faz uso de
enzimas purificadas – neste caso, DNA polimerases. Para compreender melhor como funcionam
os métodos de terminação de cadeia, é preciso recordar a estrutura dos nucleotídeos e o modo
de ação das DNA polimerases. Desoxirribonucleotídeos são substratos para DNA polimerase,
que requer extremidades 3’-OH livres para a síntese de DNA. A estrutura de um
desoxirribonucleotídeo está representada na Figura 11.22. Durante o sequenciamento de DNA
de Sanger, são adicionados didesoxirribonucleotídeos (ddNTP) às reações de síntese de DNA in
vitro. Estes são diferentes dos desoxirribonucleotídeos por apresentarem uma substituição do
grupo 3’-OH por um hidrogênio (Figura 11.22). Logo, esses nucleotídeos podem ser utilizados
normalmente pela DNA polimerase durante a síntese de DNA; contudo, uma vez incorporados,
impedem que a síntese de DNA continue, por não terem grupo 3’-OH, essencial para a formação
de uma ligação fosfodiéster subsequente. O sequenciamento de Sanger original utiliza quatro
reações diferentes de polimerização de DNA in vitro. Cada uma dessas reações contém um
excesso de desoxirribonucleotídeos normais (dNTP) e um dos quatro didesoxirribonucleotídeos.
Tome como exemplo a reação feita com dNTP + ddATP mostrada na Figura 11.23. Eles são
misturados ao fragmento de DNA que se deseja sequenciar, juntamente com um iniciador
marcado radioativamente na sua ponta 5’, e uma DNA polimerase. A DNA polimerase começará
a incorporar os nucleotídeos na síntese de uma fita complementar, mas eventualmente
incorporará o ddATP, causando a interrupção da síntese. Imagine que essa reação está sendo
feita com milhares de cópias idênticas desse fragmento de DNA ao mesmo tempo no tubo.
Assim, o produto final é uma coleção de fragmentos de tamanhos diferentes, todos eles
terminados em A por incorporação do ddATP em diferentes posições. Agora considere que
foram feitas reações também com ddCTP, ddGTP e ddTTP. As reações são então submetidas à
eletroforese em gel de poliacrilamida, e as bandas do gel reveladas por autorradiografia. É
possível então determinar a sequência de nucleotídeos do DNA em questão (Figura 11.23).
É importante notar que o sequenciamento de Sanger requer o uso de uma DNA
polimerase. Consequentemente, para que ocorra a reação de sequenciamento, é necessário um
iniciador que se anele na região imediatamente a montante (ou seja, a 5’) da região de interesse.
Já foi mostrado neste capítulo que pequenos oligonucleotídeos em fita simples podem ser
sintetizados in vitro, um processo rotineiro também no uso da tecnologia da reação em cadeia
