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Este estudo analisou a expressão e atividade da proteína de resistência a múltiplos fármacos (p-gp) em células do sangue de pacientes com tuberculose multirresistente (tbmr) tratados com diferentes regimes de medicamentos. Foram consideradas variáveis como idade, raça, tempo de tratamento e dosagem de drogas no momento da coleta de sangue e sua correlação com a expressão e atividade da p-gp. O uso de citometria de fluxo permitiu a determinação quantitativa da expressão e atividade da p-gp em linfócitos, monócitos e granulócitos.
Tipologia: Teses (TCC)
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Não perca as partes importantes!
Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas
Tese apresentada ao Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências do Programa de Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas, sob orientadora Profª Drª Liane de Castro.
Para minha família querida!
À minha orientadora por todo apoio, conhecimento e seus pontos de vista e por me apresentar a importância dos estudos em Farmacogenética. À colaboradora neste estudo e esposa Simone Carvalho Neves pelo apoio constante e dedicação na realização deste projeto. À Dra. Marli Jane pelo apoio, visão clínica e dedicação para que o estudo acontecesse, por contribuir para o desenvolvimento da pesquisa clínica com visão interdisciplinar. À Dr. Simone Silva pela revisão da tese e os incentivos. À Dra. Valéria Rolla pelo total apoio ao projeto e sua valorosa contribuição. À chefe da coleta Solange Alves Cruz e sua equipe pelo apoio, sem o qual este estudo não seria possível. Aos profissionais do ensino, Priscilla, Carla, Tati e Marcelo pelo apoio constante quando eu desanimava. À Profa. Dra. Marizete pelo apoio constante para que eu não desistisse nos piores momentos no decorrer deste estudo. À Dra. Cristina Poças pelas palavras de apoio, cobranças positivas. Aos professores de todas as disciplinas que cursei durante o período de tese. Ao Dr. Alejandro que sempre mostrou preocupação com a continuidade do meu doutoramento e palavras de apoio. À Dra. Valdiléa por me autorizar cursar o doutorado e todo apoio imprescindível. Ao colega Douglas Baeta que por várias vezes me substituiu na Chefia do Sial para eu fazer as disciplinas. À todos os meus colegas que direta ou indiretamente me deram força e contribuíram para a conclusão desta etapa.
Graças a Deus!
Neves, Jr I. Evaluation of MDR1 gene expression (P-glycoprotein) and activity of peripheral blood cells of tuberculosis patients undergoing multidrug resistant treatment, Rio de Janeiro, 2013. 81 f. Tese [Doutorado em Pesquisa Clínica em Doenças Infeciosas] - Evandro Chagas Clinical Reseach Institute.
When two or more drugs are administrated, such interactions can cause additive, synergistic or antagonistic effects. The drug transporters may undergo treatments effects and therefore change the drugs bioavailability during the treatment and can cause treatment failure. Among the known drug transporters there is transmembrane P-glycoprotein (P -gp). It is a 170 KDa transmembrane protein which is a product of multidrug resistance MDR1 gene. This protein is a well-characterized ABC transporter (ATP Binding Cassette) and is responsible for efflux of the chemotherapeutic agents from resistant cancer cells. There are few studies about this protein in multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB). In this study, P-gp expression and activity were detect by flow cytometry in monocytes, the main cell related with the M.tuberculosis infection, as well as in lymphocytes and granulocytes from whole peripheral blood. P-gp mediated efflux was determined indirectly by measuring the retention of a fluorescent P-gp substrate, rhodamine 123 (Rho123). P-gp expression was assessed using anti-P-gp monoclonal antibody UIC2 (CD243). The efflux activity with whole blood using flow cytometry technique as a new tool to pharmacogenetic research was developed in this study. We analyzed 52 % of outpatient in MDR-TB treatment from Laboratory Research Mycobacteriosis Institute Evandro Chagas Clinical Research (IPEC). We considered variables as age, race, treatment time, amount of drug administered at the time of blood collection and their correlation with P-gp expression and activity. The result revealed a correlation between the P-gp expression in monocytes and age (P < 0.01). In addition, difference between white and nonwhite patients was observed. Lymphocyte P-gp expression was statistically significant greater in patients with increased monocytes efflux activity evidenced by P-gp inhibition with CSA (P < 0.05). Patients undergoing MDR-TB treatment for six months had a higher P-gp expression in lymphocytes compared to those who received the treatment for more than six months (P < 0.01).
Keywords: 1. MDR1 2. P-Glycoprotein expression 3. Multiresistant Tuberculosis 4. Flow Cytometry
ABC - ATP Binding cassete ADN - Ácido desoxirribonucleico CI – Coeficiente de Incidência CSA – Ciclosporina-A CYP3A4 – Citocromo P450 3A DNR - Dauromicina DP – Desvio Padrão ECD – Texas red EP – Erro Padrão FITC - Fluoresceína HIV – Vírus da imunodeficiência Humana IQR – Intervalo interquartil MDR-TB - Multidrug-resistant tuberculosis NADPH - MDR-1 - Multidrug resistance protein 1 OATP - (do inglês, organic anion transporting (polypeptide) – Polipeptídio transportador de ânios orgânicos OCT - (do inglês, organic cation transporter) - transportador de cátions orgânicos OAT - (do inglês, organic anion transporter) - transportador de ânions orgânicos OMS – Organização Mundial de Saúde P-gp – Glicoproteína-P PE - Ficoeritrina PerCP -Proteína Peridinina Clorofila PEDY647 – R- Ficoeritrina Dyomics 647 PC5 – Ficoeritrina - 5 PCR – Reação da polimerase em Cadeia PI – Iodeto de Propídeo 7-AAD - 7- aminoactinomicina- PXR - Pregnane X receptor Rho-123 – Rodamina – 123
RIF - Rifampicina RI – Rifampicina e Isoniazida RIPE - Rifampicina/Isoniazida/Pirazinamida/Etambutol. SNPs - (do inglês, single nucleotide polimorphism) - Polimorfismo de nucleotídeo único SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificação TB - Tuberculose TBMR – Tuberculose Multirresistente TSA – Teste de Susceptilbilidade a Antibióticos TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Χ - Média XDRTB - (do inglês, Extensively Drug-Resistant Tuberculosis) - Tuberculose Amplamente Resistente
As variações na resposta ao tratamento podem sofrer influências do metabolismo do indivíduo. Em geral, os medicamentos são convertidos em metabólitos mais solúveis em água, facilitando sua excreção. Esse processo envolve reações de fase I (oxidação, redução e hidrólise), reações de fase II (conjugação, acetilação, glicuronidação, sulfatação e metilação) e de fase III (excreção por transportadores de membranas) (Wilkinson, 2005). A significância clínica da P-gp e da enzima CYP3A4 (Citocromo P450 3A4) está na combinação das enzimas metabolizadoras e as proteínas transportadoras que têm um papel determinante na taxa de absorção de xenobióticos do lúmen intestinal para o sistema circulatório (König et al., 2013). Muitos compostos que são substratos da P-gp também são substratos de CYP3A4. De maneira semelhante ao que ocorre nos enterócitos, ocorre também no fígado e nos rins onde ambos, P-gp e CYP3A4, são expressos. Então, devido à co- expressão e sobreposição de especificidade é aceitável que ambos atuem sinergisticamente, limitando a absorção de drogas e também seu metabolismo e consequentemente a biodisponibilidade (Zoppi et al., 2000). Portanto, o significante impacto na interação dessas duas proteínas sobre as interações droga-droga é indiscutível. Entretanto, a magnitude dessas interações e seus efeitos nos indivíduos dependem da sua conformação bioquímica, ou seja, a droga é um substrato indutor ou inibidor do CYP3A4 e/ou P-gp (König et al., 2013). Evidências de que as enzimas metabolizadoras e as proteínas transportadoras podem afetar profundamente o metabolismo das drogas, ocorre, por exemplo, quando duas ou mais drogas são administradas para o tratamento do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), podendo gerar efeitos sinérgicos ou antagonistas (König et al., 2013). As interações medicamentosas podem resultar em inesperado risco de vida e até mesmo toxicidades letais. Até 10% de todas as admissões em hospitais gerais são causadas pelo uso de combinações de fármacos, resultado de potenciais e graves interações medicamentosas (Fattinger et al., 2000). As reações adversas medicamentosas podem ser especialmente graves quando estas interações envolvem agentes citotóxicos anticancerígenos. A interferência dos “ATP binding cassette” (ABC) e outros transportadores estão cada vez mais sendo identificada como um mecanismo clinicamente importante nas interações medicamentosas (Beijnen & Schellens, 2004; Marchetti et al., 2007).
O tratamento dos pacientes com tuberculose multirresistente (TBMR) realizado em regime de múltiplas drogas está sujeito a sinergismos e antagonismos entre as mesmas, podendo aumentar ou diminuir a biodisponibilidade de uma ou outra droga correlacionada com a expressão e atividade da P-gp. Entretanto, não há estudos desta natureza na literatura envolvendo pacientes TBMR. Esta ausência de dados na literatura foi um fator importante para estimular a realização deste estudo.
Descrever a atividade de efluxo e a expressão da P-gp em pacientes TBMR acompanhados no ambulatório do Laboratório de Micobacterioses do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC).
Implantar a técnica de quantificação da expressão da P-gp em células do sangue total periférico por citometria de fluxo;
Implantar a técnica de determinação da atividade de efluxo utilizando sangue total periférico por citometria de fluxo;
Determinar a frequência da expressão da P-gp nos monócitos, linfócitos e granulócitos do sangue periférico de pacientes TBMR;
Correlacionar a atividade de efluxo pela P-gp e sua expressão em monócitos com diferentes parâmetros biológicos de relevância clínica.
O tema desta tese foi escolhido por se tratar de uma contribuição de fundamental importância para um maior conhecimento da tuberculose TBMR e também pelo fato da
A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis e pode acometer vários órgãos e/ou sistemas do corpo humano. A apresentação da TB na forma clínica pulmonar é a mais frequente e também a mais relevante para a saúde pública, pois é essa que quando bacífera, a responsável pela manutenção da cadeia de transmissão da doença (Ministério da Saúde, 2011). A TB pode se apresentar como formas clínicas: pulmonar e extrapulmonar. Na forma clínica pulmonar pode-se apresentar sob a forma primária (mais comum em crianças), pós- primária (ou secundária) (mais comum em adolescentes e adulto jovem) ou miliar (mais comum em crianças e adultos jovens). Os sintomas clássicos da TB pulmonar são: tosse persistente, produtiva ou não (com muco ou eventualmente sangue), febre vespertina, sudorese noturna e emagrecimento (Ministério da Saúde, 2011). As apresentações extrapulmonares da TB têm seus sinais e sintomas dependentes dos órgãos e/ou sistemas acometidos. Sua ocorrência aumenta entre pacientes com AIDS avançada. As principais formas clínicas da TB extrapulmonar são: TB pleural, TB ganglionar periférica, TB meningoencefálica, TB pericárdica e TB óssea (Ministério da Saúde, 2011). A TB continua sendo um importante problema de saúde no Brasil e no mundo. O Brasil é um dos 22 países priorizados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) que concentra 80% da carga mundial de tuberculose. No País, foram notificados 70.047 casos novos em 2012, no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN), o que equivale ao coeficiente de incidência (CI) de 36,1/100.000 habitantes (Ministério da Saúde, 2013). Quando comparado aos outros países, o Brasil ocupa a 17ª posição em relação ao número de casos no mundo (Ministério da Saúde, 2011). Mesmo havendo tendência de queda dos dois indicadores, o Brasil ainda não conseguiu alcançar a meta, estipulada pela OMS – curar 85% dos casos novos bacilíferos. Em 2010, a proporção de cura foi de 73,4% e em 2011 alcançou-se 71,6% (Ministério da Saúde, 2013). Para o enfrentamento da tuberculose, o Ministério da Saúde pretende implantar um método de diagnóstico que já avalia a resistência à Rifampicina através do PCR em tempo real, permitindo identificar o Mycobacterium tuberculosis em duas horas, mas hoje ainda são a baciloscopia e a cultura os métodos preconizados para o diagnóstico. A pesquisa do bacilo
álcool-ácido-resistente (baciloscopia) é, atualmente, a técnica mais utilizada no Brasil, não apenas para o diagnóstico, como também para o controle do tratamento. Desde que executada corretamente em todas as suas fases, ela permite detectar de 60 a 80% dos casos, com resultado em até 24 horas. Em 2012, dos 59.972 casos de TB pulmonar registrados no País, 85,8% realizaram baciloscopia no momento do diagnóstico da TB, desses 37.907 (73,7%) tiveram o resultado positivo (Ministério da Saúde, 2013). A cultura, metodologia considerada “padrão ouro” para o diagnóstico da tuberculose, quando associada à identificação e teste de sensibilidade aos antimicrobianos, permite o diagnóstico dos casos de TB resistente a drogas. No entanto, esse método pode levar dois meses para fornecer o resultado (Ministério da Saúde, 2013; WHO, 2010).
2.1.1 A Resistência ao Tratamento da Tuberculose
No Brasil, o esquema de tratamento para TB mais utilizado consiste no uso de Rifampicina (R), Isoniazida (I), Pirazinamida (P) e Etambutol por dois meses, seguidos por RI por quatro meses (Esquema básico), totalizando seis meses de tratamento. A inclusão do Etambutol no tratamento da TB foi iniciada no final do ano de 2009, sendo indicado para todos os casos de TB pulmonar ou extrapulmonar (exceto meningite). Em pacientes com evolução clínica inicial não satisfatória e TB extrapulmonar, como meningoencefalites, o tempo de tratamento poderá ser prolongado, na sua 2ª fase, por mais três meses (2RIPE/7RI) (Ministério da Saúde, 2011). O esquema básico também é utilizado em casos de recidiva após cura (até o resultado do TSA), em pacientes em tratamento por mais de 30 dias que necessitem de nova terapia ou em casos de retorno após abandono (Ministério da Saúde, 2011). A resistência aos fármacos anti-TB pode ser classificada em: resistência natural que surge naturalmente no processo de multiplicação do bacilo; resistência primária onde é observada em pacientes nunca tratados para TB, mas contaminados por bacilos previamente resistentes e a resistência adquirida ou secundária identificada em pacientes com TB inicialmente sensível, mas que se tornam resistentes após a exposição aos medicamentos. Na resistência adquirida, as principais causas são em decorrência de esquemas inadequados, uso irregular do esquema terapêutico por má adesão ou falta temporária de medicamentos. Porém, a resistência do Mycobacterium tuberculosis aos esquemas terapêuticos propostos vem se tornando cada vez mais frequente, representando a maior ameaça à efetividade do controle da TB. Isso torna o tratamento mais longo e consequentemente mais dispendioso, trazendo
produzidos, como a farmacocinética, que relaciona os eventos de absorção, distribuição, metabolismo e excreção da substância à sua concentração sistêmica (Wang &Weinshilboum, 2006).
QUADRO 1- Regime de Tratamento para TBMR
REGIME DROGAS DOSES POR PESO MESES Até 20kg 21kg a 35kg 36kg a 50kg > 50kg
2SSELZT Fase Intensiva 1 a^ etapa
Estreptomicina 20mg/kg/dia 500mg/dia 750mg/dia - 1000mg/dia
1000mg/dia
2
Etambutol 25mg/kg/dia 400mg/dia - 800mg/dia
800mg/dia - 1200mg
1200mg/dia Levofloxacina 10mg/kg/dia 250mg/dia - 500mg/dia
500mg/dia - 750mg/dia
750mg/dia Pirazinamida 35mg/kg/dia 1000mg/dia 1500mg/dia 1500mg/dia Terizidona 20mg/kg/dia 500mg/dia 750mg/dia 750mg/dia - 1000mg/dia 4S3ELZT Fase Intensiva 2 a^ etapa
Estreptomicina 20mg/kg/dia 500mg/dia 750mg/dia - 1000mg/dia
1000mg/dia
4
Etambutol 25mg/kg/dia 400mg/dia - 800mg/dia
800mg/dia - 1200mg
1200mg/dia Levofloxacina 10mg/kg/dia 250mg/dia - 500mg/dia
500mg/dia - 750mg/dia
750mg/dia Pirazinamida 35mg/kg/dia 1000mg/dia 1500mg/dia 1500mg/dia Terizidona 20mg/kg/dia 500mg/dia 750mg/dia 750mg/dia - 1000mg/dia 12 ELT Fase de Manutenção
Etambutol 25mg/kg/dia 400mg/dia - 800mg/dia
800mg/dia - 1200mg/dia
1200mg/dia Levofloxacina 10mg/kg/dia 250mg/dia -500mg/dia 500mg/dia -750mg/dia 750mg/dia 12 Terizidona 20mg/kg/dia 500mg/dia 750mg/dia 750mg/dia - 1000mg/dia
Esquema de tratamento para TBMR segundo o Manual de Recomendações para o Controle da Tuberculose
2.1.2 Biotransformação dos Fármacos
Diversos Fármacos são lipofílicos, e esta característica permite ao fármaco atravessar as membranas das células dos tecidos, como ocorre na mucosa do intestino mucosa, que é responsável por metabolizar alguns fármacos com maior intensidade do que o fígado, ou no tecido-alvo. O mesmo processo químico que aumenta a biodisponibilidade dos fármacos tem
influência sobre a excreção renal, visto que a depuração pelo rim exige que esses fármacos se tornem mais hidrofílicos, de modo que possam ser solúveis na urina aquosa. Então, as reações de biotransformação geralmente têm por finalidade aumentar a hidrofilicidade dos compostos tornando-os mais susceptível de serem excretados pelos rins (Bjornsson et al., 2003; Zhang et al., 2006). As reações de biotransformação foram classificadas em dois grupos: as reações de fase I (de oxidação/redução) e fase II (de conjugação/hidrólise). Tradicionalmente, as reações de oxidação geralmente converte o fármaco ingerido em um metabólito mais polar pela introdução ou desmascaramento de grupos funcionais polares, como grupos hidroxila (-OH), tiol (-SH) ou amina (-NH2). Com frequência, esses metabólitos são farmacologicamente inativos, embora em alguns casos a atividade seja apenas modificada ou até ampliada. Após este processo esses metabólitos podem ser secretados sem qualquer modificação adicional. Muitos produtos da fase I não são eliminados rapidamente e sofrem uma reação subsequente no qual um substrato como o ácido glicurônico, ácido sulfúrico, ácido acético ou um aminoácido (Wilkinson 2005; Zhang et al., 2006). Esta reação é uma conjugação de fase II que modificam os compostos criando conjugados mais polares do que os metabólitos da fase I. As reações de conjugação ocorrem independentemente ou em ordem inversa das reações de oxidação/redução e pode haver uma competição pelo mesmo substrato entre as enzimas envolvidas nas reações de oxidação/redução e de conjugação/hidrólise. (Yuan et al., 2002; Ho & Kim, 2005; Wilkinson, 2005; Zhang et al., 2009).
2.1.3 Reações de Oxidação/Redução
Muitas enzimas envolvidas na reação de fase I localizam-se nas membranas do retículo endoplasmático dos hepatócitos e também nas células de outros tecidos. As enzimas responsáveis por essas reações de fase I são caracterizadas como oxidases; essas enzimas são, em sua maioria, hemoproteínas monooxigenases da classe do citocromo P450. As enzimas P450 (CYP) também são classificadas como oxidases de função mista microssômicas. Essas enzimas estão envolvidas no metabolismo de cerca de75% de todos os medicamentos utilizados atualmente (Wilkinson, 2005; Zhang et al., 2009). A reação continua assim que fármaco se conjuga ao citocromo P450 oxidado (Fe3+^ ), formando um complexo que, a seguir, é reduzido através de duas etapas distintas de oxidação/redução sequenciais (Wu & Benet 2005; Andersson et al., 2005). O fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídio (NADPH) é o principal doador de elétrons em todas as etapas, utilizando uma flavoproteína redutase. Na primeira etapa, ocorre
