UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
WILLIAN BONELI DE ALMEIDA
ATIVIDADE NUCLEÁSICA DO COMPLEXO trans-[Ru(II)Cl
2
(nic)
4
]
SOBRE O ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLÉICO “IN VITRO” E “IN VIVO”
CRICIÚMA, NOVEMBRO DE 2006.
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ATIVIDADE NUCLEÁSICA DO COMPLEXO trans-[Ru (II) Cl2 (nic) 4]-Willian [29-11-06], Trabalhos de Farmácia
Trabalho de conclusão de curso
Tipologia: Trabalhos
2012
1 / 97
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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
WILLIAN BONELI DE ALMEIDA
ATIVIDADE NUCLEÁSICA DO COMPLEXO trans -[Ru(II)Cl 2 (nic) 4 ]
SOBRE O ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLÉICO “IN VITRO” E “IN VIVO”
CRICIÚMA, NOVEMBRO DE 2006.
WILLIAN BONELI DE ALMEIDA
ATIVIDADE NUCLEÁSICA DO COMPLEXO trans -[Ru(II)Cl 2 (nic) 4 ]
SOBRE O ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLÉICO “IN VITRO” E “IN VIVO”
Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado para obtenção do grau de Farmacêutico no curso de Farmácia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC.
Orientador: Prof. Msc. Claus Tröger Pich
CRICIÚMA, NOVEMBRO DE 2006.
Dedico esse trabalho para toda a minha família, aos meus colegas pesquisadores do Grupo de Pesquisa em Imunológia e Genética Ambiental – GPIGA, e para todos que de alguma maneira contribuíram para minha formação profissional.
AGRADECIMENTOS
Deixo expressos meus sinceros agradecimentos às seguintes pessoas e instituições, das quais ajudaram em muito, durante o período da minha graduação e no desenvolvimento deste trabalho. Agradeço especialmente ao professor orientador e amigo Claus Tröger Pich pelo apoio e incentivo prestados durante toda minha permanência na pesquisa e além de sua participação ativa neste trabalho. Agradeço ao Professor Marcos Marque da Silva Paula pelo fornecimento do complexo que possibilitou a realização do projeto e também pela amizade. Agradeço ao Grupo de Pesquisa em Imunológia Genética Ambiental – GPIGA, pela oportunidade de trabalho e pela verba destinada à realização deste trabalho. Agradeço aos colegas pesquisadores do GPIGA: Bruno Castro Caurio, Geverson Teixeira Jean Borges Bertoldo, Juliano Urbano Bobassaro, Luceli Ficagna, Rodrigo Costa Zeferino, Tiago Bortoloto, Juana Villatore, Larissa Pavei, que contribuíram em muito na realização deste trabalho e principalmente pela amizade. Agradeço ao professores integrantes do GPIGA: Silvio Ávila Junior, Tatiana Shoenfelder, Reginaldo Geremias e Cláudio Ricken. Agradeço aos técnicos do Laboratório de Bioquímica, Sinara Colonetti, Tiago Inácio, Mara e Geovana pela amizade destes anos todos. Agradeço a minha família, meu pai João Batista de Almeida, minha mãe Rosania Boneli de Almeida e a meu irmão Lucas Boneli de Almeida, pelo estímulo e apoio incondicional desde há primeira hora; pela paciência e grande amizade com que sempre me ouviram, e sensatez com que sempre me ajudaram.
RESUMO
A química sintética dos complexos coordenados por íons metálicos de transição, tem possibilitado diversas combinações por sua capacidade de afinidade com diversos ligantes. Atualmente é resultado de trabalho intenso por parte de vários grupos de pesquisa, com especial atenção ao seu potencial terapêutico e a compreensão das atividades desempenhadas por metais e metaloenzimas em sistemas naturais. Complexos de rutênio são de grande interesse, devido a forte estabilização do campo ligante e afinidade e habilidade de ajustar diversos tipo de ligantes e apresentam um grande potencial redox. O complexo trans- [Ru(II)Cl 2 (piridina-3-ácido carboxílico) 4 ] foi descrito como agente antioxidante, onde demonstrou interferência em reações envolvendo espécies químicas como NO e H 2 O 2 , apresentou atividade genotóxica em testes ''in vitro'', entre outras características. Levando em consideração estes resultados, este trabalho objetivou aumentar o conhecimento dos efeitos biológicos deste complexo através de testes de genotoxicidade e mutagênese “in vivo” , além de testes de sua interação com DNA plasmidial “in vitro” .Após a aprovação pelo comitê de ética desta universidade a genotoxicidade (teste cometa) e mutagênese (teste de micronúcleo) , utilizando-se 6 camundongos CF1 para o teste cometa e 3 para o teste de micronúcleo. Os animais foram tratados com complexo via intraperitoneal nas concentrações de (45,2; 90,4; 180,7μM/Kg) e com o respectivo controle. O período de exposição para todos os camundongos foi de 0 a 120 minutos para o teste cometa (sangue periférico) e de 24 horas para o teste de micronúcleo (células de medula óssea). Na análise de interação do complexo e do ligante com moléculas de DNA, foi analisada em incubações contendo plasmídeo pBSK-II com complexo nas concentrações de (250, 500 e 1000μM) para os respectivos pHs (6,0; 7,0 e 8,0) foram realizadas à 37ºC por 16h, para análise do possível mecanismo de clivagem foram analisadas em incubações contendo DMSO. A cinética de catalítica do complexo sobre o DNA foi realizada com incubações em pH 6,5 monitoradas por 480 minutos. O teste estatístico utilizado para todos as análises foi à análise de variância ANOVA através do programa Microcal Origin 6.0.O complexo foi capaz de clivar o DNA, porem essa atividade é diferente em cada pH testado, observando-se uma maior atividade em pH 6,0. Em incubações de complexo e DNA contendo DMSO a atividade de clivagem foi diminuída mais não inibida sugerindo um possível mecanismo oxidativo envolvendo as reações de Fenton e Haber-Weiss, e uma possível atividade hidrolítica. Na incubação de DNA com ligante não complexado, os resultados obtidos foram nulos, demonstrando ser a atividade nucleásica característica do complexo. Os resultados de cinética realizados a partir da reação de Michaelis-Menten, demonstraram os valores para os seguintes parâmetros analisados, Vmax= 1,4x10-3mol min-1, Km= 457,14μM e Kcat= 8,4x10-2^ h-1. A eficiência catalítica observada foi de 183,75M-1.h-1^ e o valor de Enhancement para a aceleração da reação foi de 2,33x10^6. Efeitos genotóxicos “in vivo” foram observados, levando em consideração que esses efeitos são diferentes para cada concentração testada e o tempo de exposição dos animais ao complexo. Foi observada também uma atividade mutagênica do complexo nas concentrações testadas.
Palavras-chave: Complexos de Rutênio; Clivagem de DNA; Genotoxicidade e Mutagênese.
LISTA DE FIGURAS
Figura 8 – O espectro de absorbância ao UV do DNA de E. coli nativo e desnaturado pelo
Figura 12 – Medida do superenrolamento. Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeo. O DNA aparece como bandas claras(fluorescente) na presença de UV. (a)
Figura 42 – Atividade catalítica de diversas concentrações do complexo sobre o DNA plasmidial pBSK-II em 480 minutos de incubação a um temperatura de 50ºC em pH 6,5. .... 64 Figura 43 – Constante catalítica do complexo calculado em base a concentrações crescentes de complexo e a quantidade em moles de substrato degradado por minuto. .......................... 64 Figura 44 – modelo de Lineweaver-Burk ............................................................................ 65 Figura 45 – Índice de fragmentação do DNA de células sangüíneas de camundongos CF1.. 66 Figura 46 – Percentual de células sangüíneas de camundongos CF1, com o seu DNA fragmentado......................................................................................................................... 68 Figura 47 – Percentual de micronúcleo encontrados em eritrócitos policromáticos, da medula óssea de camundongos CF1. (*p<0,05). ............................................................................... 69 Figura 48 – Reação de Fenton adaptada para o íon de Ru(II)............................................... 71 Figura 49 – Reação proposta de hidrolise da ligação fosfodiéster do DNA plasmidial (pBSK- II) causado pelo complexo de rutênio trans-[RuCl2(nic)4]. .................................................. 72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Fotos dos géis das incubações do ligante e complexo. ....................................... 55 Tabela 2 – Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do ligante com o DNA plasmidial ............................................................................................................................ 56 Tabela 3 – Porcentagem da formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA plasmidial. ........................................................................................................................... 58 Tabela 4 – Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA em ausência e presença de DMSO em pH 6,0. ........................................................................... 60 Tabela 5 – Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA em ausência e presença de DMSO em pH 7,0. ........................................................................... 61 Tabela 6 – Porcentagem das formas plasmidiais das incubações do complexo com DNA em ausência e presença de DMSO em pH 8,0. ........................................................................... 62 Tabela 7 – Fotos do Géis do experimento de cinética catalítica do complexo....................... 63 Tabela 8 – Valores do índice de fragmentação do DNA....................................................... 66 Tabela 9 – Valores da freqüência de células com DNA danificado. ..................................... 68 Tabela 10 – Porcentagem de micronúcleos .......................................................................... 69
trans -[RuCl 2 (nic) 4 ] - trans- Dicloro Tetraquis Ácido-3-piridina Carboxílico Rutênio Tris - tris(hidroximetil) aminometano Triton X-100 - éter p-t-octilfenil polioxietileno U – uracila uM – micromolar UV-Vis – ultravioleta - visível λ – comprimento e onda μg – microgramas μL - microlitros K obs – constante observada
SUMÁRIO
- Figura 1 – Bases nitrogenadas
- Figura 2 – Ligações fosfodiéster entre nucleotídeos
- DNA ou uma Hidroxila no caso do RNA. Figura 3 – Estrutura química de um nucleotídeo. O “R” pode ser um Hidrogênio no caso do
- Figura 4 – Modelo Watson-Crick para Estrutura do DNA
- Figura 5 – Pareamento de bases
- Figura 6 – Pareamento de Hoogsteen
- Figura 7 – Representação esquemática da desnaturação e renaturação do DNA....................
- apenas aumenta sua intesidade. calor. Observe que a desnaturação não muda o formato geral da curva de absorbância, mas
- Figura 9 – Formas do DNA................................................................................................
- Figura 10 – Conformação da pentose
- Figura 11 – Supertorção do DNA........................................................................................
- I; (d) 1,0μMol de topoisomerase I; (e) 2,0μMol de topoisomerase I. 0μMol de topoisomerase I (b) 0,25μMol de topoisomerase I; (c) 0,50μMol de topoisomerase
- Figura 13 – Mecanismo hidrolítico da endonucleases sobre os ácido nucléicos.
- Figura 14 – Lesões provocadas por radical hidroxila (OH•) nas bases purínicas..................
- Figura 15 – Lesões provocadas por radical hidroxila (OH•) nas bases pirimidínicas
- Figura 16 – dímeros de pirimidinas CPD (Dímero de pirimidina ciclobutano) e o 6-
- (Pirimidina 6,4 pirimidona fotoproduto)...............................................................................
- Figura 17 – Lesões geradas pelo radical hidroxila (OH•) na pentose do DNA.
- Figura 18 – Junção Holliday
- Figura 19 – Análogos de Base.............................................................................................
- Figura 20 – Agentes químicos intercalantes de DNA...........................................................
- Figura 21 – Estrutura da Cisplatina e Carboplatina..............................................................
- Figura 22 – Estrutura do complexo [Ru(III)Cl 4 (DMSO)(H-Hipoxantina)].1,78 H2O...........
- Figura 23 – Estrutura do complexo [Ru(III)Cl 4 (DMSO)[H-N6-butiladenina)]]....................
- Figura 24 – estrutura do complexo NAMI-A (ImH)[trans-Ru(III) Cl 4 (DMSO-S)]
- 1 INTRODUÇÃO...............................................................................................................
- 2 JUSTIFICATIVA............................................................................................................
- 3 OBJETIVOS
- 3.1 Geral
- 3.2 Especifico......................................................................................................................
- 4 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
- 4.1 Ácidos nucléicos............................................................................................................
- 4.1.1 Propriedades Físicas e Químicas do DNA
- 4.1.1.1 Modelo Watson–Crick para estrutura do DNA..........................................................
- 4.1.1.2 Desnaturação e Renaturação do DNA.......................................................................
- 4.1.1.3 Formas Tridimensionais de DNA
- 4.1.1.4 Supertorção do DNA
- 4.1.2 Degradação do DNA por Nucleases
- 4.1.3 Danos e Sistemas de Reparo......................................................................................
- 4.1.3.1 Reparo Por Excisão de Bases....................................................................................
- 4.1.3.2 Reparo Por Excisão de Nucleotídeos
- 4.1.3.3 Reparo Por Recombinação........................................................................................
- 4.1.3.4 Reparo Sujeito a Erros..............................................................................................
- 4.1.4 Genotoxicidade
- 4.1.4.1 Mutação e Câncer.....................................................................................................
- 4.2 Complexos organometálicos.........................................................................................
- 4.2.1 Complexos de Lantanídeos
- 4.2.2 Complexos de metais de transição
- 4.2.2.1 Complexos de Rutênio..............................................................................................
- 4.2.2.1.1 Complexo polipiridínico de Rutênio trans- [RuCl 2 (L) 4 ]
- 5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.........................................................................
- 5.1 Local.
- 5.2 Obtenção do complexo trans- [RuCl 2 (nic) 4 ]
- 5.3 Análise de Interação com Moléculas de DNA plasmidial
- 5.3.1.1 Preparação de bactérias competentes
- 5.3.1.2 Transformação das bactérias competentes.................................................................
- 5.3.1.3 Extração do DNA plasmidial das bactérias transformadas.........................................
- 5.3.1.3.1 Análise da Pureza do DNA plasmidial
- 5.3.2.1 Interação do ligante com moléculas de DNA
- 5.3.2.2 Interação do complexo com moléculas de DNA........................................................
- 5.3.2.3 Interação do complexo com moléculas de DNA na presença de DMSO....................
- 5.3.2.4 Cinética catalítica do complexo sobre o DNA...........................................................
- 5.3.3 Confecção do gel de agarose e corrida eletroforética...............................................
- 5.4 Análise de Genotoxicidade e Mutagênese....................................................................
- 5.4.1 Animais e Tratamento...............................................................................................
- 5.4.2 Análise de Genotoxicidade
- 5.4.2.1 Teste cometa
- 5.4.3 Analise de Mutagênese
- 5.4.3.1 Teste de micronúcleo................................................................................................
- 5.5. Análise Estatística
- 6 RESULTADOS
- 6.1 Análises de Interação com Moléculas de DNA plasmidial..........................................
- 6.1.1 Interação do ligante com moléculas de DNA............................................................
- 6.1.2 Interação do complexo com moléculas de DNA
- 6.1.3 Interação do complexo com moléculas de DNA em presença de DMSO......................
- 6.1.4 Cinética catalítica do complexo sobre moléculas de DNA
- 6.2. Análise de Genotoxicidade e Mutagênese...................................................................
- 6.2.1 Teste Cometa
- 6.2.1.1 Índice de Fragmentação ao DNA..............................................................................
- 6.2.1.2 Freqüência de dano ao DNA.....................................................................................
- 6.2.2 Teste Micronúcleo
- 7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS................................................................................
- 7.1 Clivagem do DNA.........................................................................................................
- 7.1.1 Atividade de clivagem do Ligante.............................................................................
- 7.1.2 Atividade de clivagem do complexo..........................................................................
- 7.1.3 Atividade de clivagem do complexo em presença de DMSO
- 7.4 Cinética Catalítica do Complexo
- 7.2 Teste Cometa
- 7.2.1 Índice e freqüência de dano ao DNA
- 7.3 Teste Micronúcleo
- 8 CONCLUSÃO.................................................................................................................
- 9 PERSPECTIVAS
- REFERÊNCIAS.................................................................................................................
- APÊNDICES
- APÊNDICE A – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TESTE DE INTERAÇÃO
- APÊNDICE B –VALORES DOS RESULTADOS DE CINÉTICA CATALÍTICA
- APÊNDICE C – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TESTE COMETA.
- APÊNDICE D – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TESTE MICRONÚCLEO..................
- ANEXO
- DESTA UNIVERSIDADE. ANEXO A – APROVAÇÃO DO TRABALHO PERANTE O COMITÊ DE ÉTICA
12
1 INTRODUÇÃO
Torna-se cada vez maior o interesse no esclarecimento de processos químicos que ocorrem em sistemas biológicos, para aumentar o conhecimento sobre a atividade de diversas macromoléculas em processos fisiológicos e patológicos. Para o entendimento desses sistemas biológicos, hoje tem acontecido a troca viva de idéias entre químicos inorgânicos e os bioquímicos, que têm conduzido ao crescimento e ao reconhecimento da área interdisciplinar de “Química Bioinorgânica”. Assim a Química Bioinorgânica tem como principal objetivo à elaboração, da síntese e da caracterização estrutural e físico-química de sítios ativos de proteínas, membranas e ácidos nucléicos. Atualmente vêm sendo muito estudados compostos coordenados por metais, para a compreensão das atividades desempenhadas por metais e metaloproteínas em sistemas biológicos. Especialmente aqueles que são capazes de clivar ácidos nucléicos em condições mais próximas das fisiológicas, de forma hidrolítica que possibilita uma clivagem do DNA com terminais religáveis enzimaticamente. Tornaram-se objeto de grande interesse por vários grupos de pesquisas, por servir como ferramenta em biologia molecular e bioquímica, e também na terapêutica. As características químicas adotadas pelos complexos coordenados por metais, de ter uma estrutura tridimensional, caráter catiônico e tendência para fazer reações redox, de hidrólise, ou fotorreações, torna-os conhecidos por interferir em processos celulares, como divisão celular e expressão de gênica. Também podem desempenhar atividades em processos não naturais como toxicidade e carcinogenicidade. Um dos primeiros complexos coordenados por metais a serem utilizados na terapêutica contra o câncer, foram os complexos a base de platina. A partir dessa descoberta houve uma procura maior de novos complexos coordenados por metais de transição com atividade contra o câncer Entre os compostos a base de platina, entra os complexos coordenados por íons de Rutênio (II, III) que apresentam características semelhantes, e através de alguns testes “ in vitro” , indícios de interação com o DNA, havendo possibilidade, em um futuro próximo, destes também se tornarem uma referência na terapia contra o câncer. O Complexo polipiridínico trans -dicloro tetraquis ácido-3-piridina carboxílico Rutênio ( trans -[Ru(II)Cl 2 (nic) 4 ]) em estudo nesse presente trabalho, apresentou em outros trabalhos indícios de influenciar em certos sistemas biológicos.
14
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Avaliar a atividade nucleásica do complexo, trans -[RuCl 2 (nic) 4 ], quanto ao seu potencial de ligação com moléculas de DNA plasmidial “ in vitro” , e conseqüentemente sua capacidade de promover dano aos ácidos nucléicos de células sanguíneas e medulares de camundongos CF1 “ in vivo”.
3.2 Especifico
Avaliar em diferentes concentrações e pHs o potencial de ligação e clivagem do complexo com moléculas de DNA plasmidial “in vitro” , utilizando técnica de eletroforese em gel de agarose; Analisar em diferentes concentrações e pHs o potencial de ligação e clivagem do ligante não complexado com moléculas de DNA plasmidial “ in vitro” , utilizando técnica de eletroforese em gel de agarose; Verificar o mecanismo de clivagem hidrolítico ou oxidativo do complexo sobre moléculas de DNA plasmidial, utilizando varias concentrações do complexo e pHs, na presença de DMSO(quelante de radicais livres) seguida de visualização em corrida eletroforetica de gel de agarose; Calcular a cinética catalítica do complexo sobre moléculas de DNA plasmidial, utilizando o modelo matemático Lineweaver-Burk para equação pseudo-Michaelis- Menten e a técnica de corrida eletroforetica de gel de agarose; Avaliar o potencial genotóxico do complexo em diferentes concentrações e tempo de exposição em sistema biológico, utilizando o ensaio cometa de células de sangue periférico de camundongos CF1; Analisar a atividade mutagênica do complexo em diferentes concentrações, utilizando teste de micronúcleo em medula óssea de camundongos CF1; Relacionar os resultados decorrentes com a estrutura do complexo e suas propriedades químicas.
15
4 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
4.1 Ácidos nucléicos
Os ácidos nucléicos são macromoléculas de enorme importância biológica. Todos os seres vivos possuem dois tipos de ácidos nucléicos, chamados ácido desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucléico (RNA). (DE ROBERTIS e HIB, 2001). O DNA ocupa uma posição central entre as macromoléculas biológicas como um repositório da informação genética. As seqüências nucleotídicas do DNA codificam as estruturas primarias de todos os RNAs e proteínas celulares e, por meio das enzimas, podem afetar indiretamente a síntese de todos os constituintes celulares. Essa passagem da informação do DNA para o RNA e as proteínas direciona o tamanho, a forma e a função de todos os seres vivos. (NELSON e COX, 2002). Toda informação genética de um organismo encontra-se acumulada na seqüência linear das quatro bases. A estrutura básica de todas as proteínas deve estar codificada por um alfabeto formando por quatro letras (A, T, G e C) na molécula de DNA e na molécula de RNA é substituída à timina (T) por uma Uracila (U). Onde a quantidade de adenina é igual á de timina (A = T) e de citosina, idem a de guanina (C = G), podemos disser que o numero total de purinas (A+G) é igual ao de pirimidinas (T+C), onde essa relação (AT/GC) possa variar espécie por espécie conforme figura 1. (ZAHA et al, 2001).
N
N
NH
N
NH 2
Adenina
N
NH
NH 2
O
Citosina
N
NH
NH
N
NH 2
O
Guanina
NH
NH
O
O
H 3 C
Timina
NH
NH
O
O
Uracila
Figura 1 - Bases nitrogenadas Fonte: modificado de Nelson e Cox (2002). Diferente dos procarióticos o DNA de eucarióticos encontra-se no núcleo constituindo os cromossomos (uma pequena quantidade se encontra no citoplasma, dentro de mitocôndrias e cloroplastos). O RNA se localiza tanto no núcleo, onde é sintetizado como no citoplasma onde se dirige para reger a síntese protéica. (DE ROBERTIS e HIB, 2001).