As vitaminas, cap.19, Notas de estudo de Química

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VITAMINAS

XIX

CAPÍTULO

Capítulo XIX - Vitaminas

Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital

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Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital

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Reagentes

Óxido de magnésio para cromatografia em coluna Celite Éter de petróleo com faixa de destilação (30-60)°C Hidróxido de potássio Metanol Acetona Sulfato de sódio anidro

Solução de hidróxido de potássio a 10% m/v – Pese 10 g de hidróxido de potássio, dissolva em metanol e complete a 100 mL.

Fase estacionária – Pese o óxido de magnésio e a celite na proporção (1:2). Transfira para um frasco fechado. Agite bem para homogeneizar, antes do empacotamento da coluna cromatográfica.

Procedimento – Adapte a coluna a um kitassato de 500 mL, coloque um pouco de lã de vidro na parte inferior da coluna e adicione aos poucos a mistura preparada com óxido de magnésio-celite (1:1), com auxílio da trompa d′água, até aproximadamente 10 a 15 cm. O empacotamento deve ficar uniforme, sem sulcos ou falhas e não muito compactado. Triture e homogeneíze 500 g da amostra e pese aproximadamente 10 g. Extraia os pig- mentos com acetona resfriada com auxílio do liqüidificador ou agitador mecânico. Filtre através de um funil de Büchner. Repita esta operação até o resíduo ficar incolor. Junte todos os extratos de acetona contendo os carotenóides e armazene sob a proteção da luz. Coloque 100 mL de éter de petróleo no funil de separação. Adicione, aos poucos, a solu- ção de acetona contendo os pigmentos extraídos, acrescentando água após cada adição. Agite, e após a separação das duas fases, descarte a camada aquosa com acetona (inferior). Repita esta operação lentamente, evitando emulsões, até a eliminação da acetona. Os pigmentos são transferidos para a fase etérea. Lave mais quatro ou cinco vezes a fase etérea para eliminar totalmente algum resíduo de acetona. Recolha a fase etérea em um frasco Erlenmeyer com tampa de 500 mL e guarde para a saponificação, protegendo da luz. Saponifique os pigmentos com adição de uma solução de KOH a 10% em metanol na proporção de 1:1 em relação ao volume do extrato de éter de petróleo. Agite e deixe esta mistura em repouso por aproximadamente 12 horas à temperatura ambiente. Elimine os resíduos de KOH com sucessivas lavagens com água em funil de separação. Adicione pequena porção de sulfato de sódio anidro para retirar a água residual da amostra.

Cromatografia em coluna – Evapore a solução anterior em rotavapor, até aproximada-

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mente 20 mL à temperatura de 35°C ou sob corrente de nitrogênio. Na coluna, previa- mente compactada e conectada à trompa d’água, adicione éter de petróleo para ume- decê-la evitando ressecamento. Junte a amostra e observe as separações das frações de carotenóides. Continue adicionando éter de petróleo até a nítida separação das frações, atingindo assim o fim da coluna. A 1a^ fração separada é o α-caroteno, de cor amarela clara, podendo também ser separada com o uso de uma solução de 2% de acetona em éter de petróleo. A 2a^ fração separada é o β-caroteno, de cor alaranjada, podendo também ser separada com o uso de uma solução a 5% de acetona em éter de petróleo Essas duas frações são as que possuem maior atividade de vitamina A e de maior interesse. Recolha, separadamente, as frações. Se na separação for utilizada acetona, ela deverá ser retirada com sucessivas lavagens com água no funil de separação. Adicione pequena porção de sulfato de sódio anidro. As fases etéreas são evaporadas, completadas a um determinado volume com solvente e as absorbâncias lidas no espectrofotômetro UV/VIS. Na 1a^ fase, o α- caroteno é identificado e quantificado por espectrofotometria na região do visível, cujo espectro característico apresenta três picos máximos de absorção, respectivamente em: 421, 443 e 472 nm. Na 2a^ fase etérea, o β-caroteno é identificado e quantificado por espectrofotometria na região do visível, cujo espectro característico apresenta três picos máximos de absorção em: 425, 448 e 475 nm.

Cálculo

A = absorbância máxima obtida no espectro de absorção V = volume do solvente no qual se encontra dissolvido o carotenóide (mL)

P = massa da amostra integral (g)

Nota: a absortividade do α-caroteno em éter de petróleo no λ = 444 nm corresponde a 2800 e a do β-caroteno no λ = 453 nm corresponde a 2592.

Referências bibliográficas

DAVIES, B.H. Carotenoids. In: GOODWIN, T.W. Chemistry and biochemistry of plants pigments. 2. ed., v. 2, London: Academic Press, 1976. p. 38-165.

RODRIGUES, R.S.M. Carotenóides com atividade pró-vitamínica A de hortaliças

Capítulo XIX - Vitaminas

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Solução alcoólica de fenolftaleína a 1% m/v - Pese 1 g de fenolftaleína, dissolva em álcool e complete o volume a 100 mL.

Procedimento – Pese 5 g de amostra, previamente triturada e homogeneizada, em um balão de fundo chato com junta esmerilhada 24/40 de 250 mL ou de 300 mL. Coloque 10 mL de glicerina e agite. Adicione 50 mL de álcool isento de aldeídos e peróxidos, 10 mL de hidróxido de potássio a 30% e aqueça em refluxo, mais ou menos a 40°C, por 30 minutos. Esfrie e transfira a solução para um funil de separação de 250 mL e extraia o ß-caroteno com duas porções consecutivas de 25 mL de éter de petróleo. Reúna os extra- tos etéreos em um segundo funil de separação de 500 mL e lave com porções de 50 mL de água, agitando suavemente até que a fase aquosa não dê coloração rósea, pela adição de algumas gotas da solução indicadora de fenolftaleína. Filtre em funil de vidro contendo sulfato de sódio anidro para um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com éter de petróleo. Determine a absorbância em espectrofotômetro a 450 nm, usando éter de petróleo como branco.

Nota : se outras substâncias estiverem presentes na amostra, passíveis de extração com o ß-caroteno, há necessidade de separá-las por cromatografia em papel, utilizando uma alíquota do extrato etéreo e uma solução de acetona a 2% em éter de petróleo como fase móvel. O ß-caroteno migra com o solvente apresentando um Rf maior que as demais substâncias interferentes.

Cálculo

A = absorbância a 450 nm obtida no espectro de absorção C = quantidade da amostra em 100 mL de éter de petróleo.

Referências bibliográficas

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz, v.1, Métodos químicos e físicos de alimentos. 3. ed., São Paulo: IMESP, p. 382-383. 1985.

LA ASSOCIACIÓN DE QUÍMICOS DE VITAMINAS, INC. Métodos de Análisis de Vitaminas. Tradução de M.ª Soledad G. Chamarro y Cláudio Fernández Heredia.

3. ed. Leon, Esp.: Editorial Academia, 1969. p. 91-114. Titulo original: Methods of Vitamin Assay.

Capítulo XIX - Vitaminas

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PEREIRA,M.R. Beta-caroteno em macarrão fortificado e avaliação da metodologia analítica. 1997. 95 f. Tese (Mestre em Ciência da Nutrição) - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas - SP.

357/IV Determinação de vitamina A em alimentos

A vitamina A, além de ser essencial na manutenção do crescimento normal das células e na diferenciação dos tecidos epitelial e ósseo, também está relacionada com a fisiologia da visão. Sua deficiência pode causar xeroftalmia (cegueira noturna). Há indi- cação de que esta vitamina influencie elementos específicos do sistema imune. Por outro lado, convém salientar que quantidades excessivas têm efeito tóxico no organismo. No estado natural, esta vitamina é encontrada somente nos animais, sendo isolada da fração insaponificável de lipídios. A fonte mais rica de vitamina A é o fígado de peixes, sendo que determinados tecidos podem conter quantidades significativas. Basicamente, a molé- cula de vitamina A é um álcool, o retinol, que está presente nos alimentos e tecidos como ésteres combinados com ácidos graxos de cadeia longa, como o ácido palmítico.

Este método baseia-se na medida da coloração azul instável, resultante da reação da vitamina A com o tricloreto de antimônio (reagente Carr Price) e é válido para a deter- minação de vitamina A em alimentos, enriquecidos ou não, rações e misturas vitamínicas ( premix ). Não é aplicável para produtos contendo pró-vitamina A (carotenos). A análise compreende as seguintes etapas: conversão dos ésteres de vitamina A à forma alcoólica correspondente por saponificação, extração e determinação colorimétrica.

Material

Colorímetro com faixa de leitura de 500 a 700 nm, cilindro de nitrogênio, placa aquecedora com agitador, tubos de colorímetro, balança analítica, balão com boca esmerilhada de 250 mL, condensador de refluxo, balões volumétricos de cor âmbar de 50 e de 100 mL, funis de separação de cor âmbar de 250 e de 500 mL, pipetas graduadas de 5 e 10 mL, pipetas volumétricas de 5 e 10 mL, funis de vidro de 5 cm de diâmetro e bastão de vidro.

Reagentes

Álcool isento de aldeídos e peróxidos Álcool Glicerina Éter de petróleo (30-60)°C Anidrido acético Sulfato de sódio anidro Clorofórmio Solução de hidróxido de potássio 30% m/v. Solução de fenolftaleína

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etéreos para um segundo funil de separação âmbar de 500 mL e lave com porções de 50 mL de água, agitando suavemente, até que a fase aquosa não apresente mais reação alcalina pela adição de 2-3 gotas de fenolftaleína. Filtre com sulfato de sódio anidro para um balão volumétrico de 50 ou 100 mL e complete o volume com éter de petróleo (solu- ção A). Ajuste o colorímetro ou o espectrofotômetro para 100% de transmitância ou zero de absorbância a 620 nm, usando água na cubeta ou no tubo do colorímetro. Transfira uma alíquota da solução A correspondente a 10-50 UI de vitamina A para um tubo do colorímetro e evapore sob nitrogênio até secagem. Dissolva o resíduo da evaporação com 3 mL de clorofórmio, adicione 4 gotas de anidrido acético e 7 mL do reagente de Carr- Price. No período de até 15 segundos após a adição do reagente Carr-Price, meça a 620 nm a absorbância da coloração desenvolvida, usando a água como referência.

Curva-padrão – Transfira, individualmente, cinco alíquotas da solução-padrão, contendo concentrações de 10 a 50 UI de vitamina A com incrementos de 10 UI para um tubo do colorímetro e siga como em procedimento da amostra. Com os dados obtidos construa uma curva-padrão.

Cálculo

Determine a quantidade de vitamina A correspondente, utilizando a curva-padrão pre- viamente estabelecida. Use a tabela abaixo para a conversão de UI em μg de vitamina A e derivados e de beta-caroteno.

1 UI de vitamina A 0,3 μg de acetato de vitamina A 1 UI de vitamina A 0,54 μg de palmitato de vitamina A 1 UI de vitamina A 1,8 μg de beta-caroteno 1 μg de palmitato de vitamina A 0,55 μg de acetato de vitamina A 1 UI de vitamina A 0,3 μg de equivalente em retinol (ER)*

*1 equivalente em retinol (ER) = 1 μg de retinol

358/IV Determinação de vitamina A em matéria-prima

Este método baseia-se na determinação da vitamina A por espectrofotometria de absorção na região do ultravioleta.

Material

Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, cubetas de quartzo, placa aquecedora com agitador magnético, cilindro de nitrogênio, balões volumétricos cor âmbar de 100 mL, balão redondo de 250 mL com fundo chato e boca esmerilhada adaptável a um refrige- rante para refluxo, condensador de refluxo, pipetas graduadas e volumétricas de vários

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volumes, funis de vidro de 5 cm de diâmetro e bastão de vidro.

Reagentes

Glicerina Solução de hidróxido de potássio 30% m/v Álcool isento de aldeídos e peróxidos Éter de petróleo (30-60)°C Solução de fenolftaleína Sulfato de sódio anidro Álcool isopropílico

Procedimento – Pese, com precisão, cerca de 0,1 g da amostra e saponifique como des- crito no procedimento 357/IV. Extraia com três porções, respectivamente, 40, 30 e 30 mL de éter de petróleo e lave os extratos etéreos com água até que a água da lavagem não apre- sente reação alcalina com 2-3 gotas de fenolftaleína. Filtre em filtro com sulfato de sódio anidro e transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL. Complete o volume com éter de petróleo. Retire uma alíquota de volume conhecido desta solução e evapore sob nitrogênio. Dissolva o resíduo em quantidade suficiente de álcool isopro- pílico para se obter uma solução com concentração de 8 a 15 UI de vitamina A por mL. Determine a absorbância a 325 nm, que é o comprimento de onda de máxima absorção da vitamina A e também a 310 e 334 nm, para efetuar a correção de outras substâncias que possam interferir na determinação. Utilize álcool isopropílico como branco.

Cálculos

A = Absorbância L = espessura da cubeta em cm C = quantidade da amostra em gramas contida em 1000 mL da solução em isopropanol 5700 = fator de conversão de unidades espectrofotométricas em gravimétricas 0,3 = fator de conversão de g em UI

Referências bibliográficas

CARR, F.H.; PRICE, E.A. Colour reactions attributed to vitamin A. Biochem. J. , v. 20, p. 497-501. 1926.

Capítulo XIX - Vitaminas

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Solução de diastase – Pese, com precisão, 0,3 g de diastase e complete o volume de 5 mL com solução de acetato de sódio.

Solução-padrão de vitamina B 1 (5 μg/mL) – Pese, com precisão, cerca de 50 mg de vita- mina B 1 , previamente seca em estufa a 110°C, durante 2 horas até peso constante. Faça diluições sucessivas de modo que a última solução contenha cerca de 5 μg de vitamina B 1 por mL. Conserve em geladeira.

Procedimentos

Produtos enriquecidos – Prepare as soluções dos produtos a analisar de modo que a solução final contenha (2,5-5) μg de vitamina B 1 por mL. Adicione 10 mL de solução de ácido sulfúrico 0,05 M para melhor dissolução. Complete o volume com água. Selecione dois funis de separação: A, para análise e P, para o padrão. Adicione, seqüencialmente: 10 mL de água aos funis A e P, 2 mL de álcool metílico aos funis A e P, 1 mL da solução da amos- tra ao funil A, 1 mL da solução-padrão ao funil P, 1 mL da solução de ferricianeto de potássio a 1% aos funis A e P e 1 ml da solução de hidróxido de sódio a 30% aos funis A e P. Agite levemente e espere dois minutos. Extraia o tiocromo formado, adicionando 10 mL de álcool isobutílico em cada funil. Agite fortemente cerca de um minuto e meio e deixe em repouso durante um a dois minutos. Elimine a camada aquosa. Passe a camada alcoólica para tubos de ensaio limpos, secos e marcados A e P. Coloque cerca de 200 mg de sulfato de sódio anidro em cada tubo de ensaio. Pipete 5 mL para balões volumétricos de 25 mL, limpos e secos (A e P). Pipete 5 mL de álcool isobutílico para balão volumétrico de 25 mL, limpo e seco e marcado B (branco). Complete o volume e homogeneíze com ál- cool destilado, livre de aldeídos e substâncias fluorescentes. Leia em espectrofotômetro de fluorescência, ajustando o 100% da escala com a solução-padrão de 5 μg/mL de vitamina B 1 ou conforme especificações do fabricante do aparelho e o zero com o branco. Use luz de excitação de 365 nm e de emissão de 435 nm.

Produtos naturais – Pese uma quantidade suficiente da amostra ou meça um volume, tal que a solução final contenha até 5 μg de vitamina B 1 por mL. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Adicione 150 mL de solução de ácido sulfúrico 0,05 M (para amostra de levedura, adicione água), misture, deixe em banho-maria em ebulição durante 30 minutos e agite de vez em quando. Retire do banho-maria e deixe esfriar à temperatura ambiente. Adicione 5 mL da suspensão de diastase preparada recentemente, ajuste o pH na faixa de 4,5 a 5,0, com a solução de acetato de sódio. Incube a amostra a (45-50)°C em banho-maria, durante duas horas. Esfrie à temperatura ambiente e transfira para um balão volumétrico de 100 ou 200 mL e complete o volume com ácido sulfúrico 0, M (para amostra de levedura, complete com água). Agite, filtre e recolha em um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Em seguida, proceda com em produtos enriquecidos.

Nota: a vitamina B 1 é sensível à luz, portanto evite a claridade durante a análise. Determi- ne, periodicamente, o teor da vitamina B 1 padrão.

Capítulo XIX - Vitaminas

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Cálculo

La = leitura da amostra P = n°de μ/mL do padrão A = n° de mL da solução de M g ou mL da amostra M = massa ou volume da amostra

ou, simplificando:

Referências bibliográficas

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz : v. 1: Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985. p. 383-385.

ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists .15 th^ ed., v. 2. Arlington: A.O.A.C., 1990. p. 1045-1047 (method 924.29).

STROHECKER, R.; HENNING, H. Vitamin Assay. Tested Methods. Tradução de D.D. Libman. 1 ed. Germany: Verlag Chemie GMBH, 1966. p. 65-90. Titulo Original: Vitamin-Bestimmungen, Er probte Methoden.

LA ASSOCIACIÓN DE QUÍMICOS DE VITAMINAS, INC. Métodos de Análisis de Vitaminas. Tradução de M.ª Soledad G. Chamarro y Cláudio Fernández Heredia.

3. ed. Leon, Esp.: Editorial Academia, 1969. p. 115-135. Titulo original: Methods of Vitamin Assay.

360/IV Determinação da vitamina B 12 em matéria-prima

Materia l

Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS com registrador, termômetro, béqueres de 10, 25 e 50 mL, pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 4, 5 e 10 mL, balões volumétricos de 25, 50, 100, 200 e 1000 mL, dessecador com sílica gel e pesa-filtro com tampa de 25 mL.

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Referências bibliográficas

FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 3. ed. São Paulo: Organização Andrei Editoria S.A.,

1997. p. 198-200.

STROHECKER, R.; HENNING, H.M. Vitamin Assay. Tested Methods. Tradução de D.D.Libman. 1. ed. Germany: Verlag Chemie. GMBH, 1966. p.151-172. Título Original: Vitamin-Bestmmungen, Er probte Methoden.

THE MERCK INDEX. 8. ed. Rahway, U.S.A.: MERCK & CO., 1968. p. 97, 547, 1112-1113.

KUTSKY R.J. Handbook of Vitamins e Hormones. Paris: Van Nostrand Reinhold Company.1973. p. 62-70.

361/IV Doseamento microbiológico de vitamina B 12

Material

Balança analítica, espectrofotômetro UV/VIS, placas de Petri estéreis, pipetas de 1, 5, 10 e 25 mL, pipetas micrométricas, bastões de vidro, béqueres de 10, 20, 30, 50, 100, 200, 250 e 500 mL, termômetro, tubos de ensaio para meios de cultura, frascos Erlenmeyer de 30, 50, 100, 250 e 500 mL, pinça anatômica reta, discos de papel para dosagem de antibiótico, papel de pH, almofariz com pistilo e papel de filtro.

Reagentes

Solução salina – Pese 20 g de cloreto de amônio, 4 g de nitrato de amônio, 8 g de sulfato de sódio, 4 g de fosfato de potássio monobásico, 12 g de fosfato de potássio dibásico e 0,823 g de sulfato de magnésio. Adicione 1000 mL de água. Aqueça até a dissolução dos sais. Dis- tribua em frasco Erlenmeyer de 500 mL e esterilize a 121°C, durante 20 minutos.

Solução-tampão de fosfato (pH=3) – Pese 9,7 g de fosfato de potássio monobásico e transfira para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione 50 mL de solução de ácido fosfórico a 1% e complete o volume com água.

Solução-padrão estoque de vitamina B 12 – Pese 100 mg de vitamina B 12 , previamente des- secada. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL. Ajuste o volume com a solução- tampão de fosfato. Dilua esta solução adequadamente de tal modo que a concentração da vitamina seja aproximadamente 50 μg/mL. Determine a concentração de vitamina B 12 por meio da leitura da absorbância a 361 nm, utilizando a relação: 1 μg/mL de vitamina B 12 = Absorbância 0,

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Microorganismos: Escherichia coli 313-3, Mutantie ou 113 ATCC

Meio para manutenção do germe – Pese 5 g de agar, 1,5 g de peptona, 0,375 g de extrato de carne, 0,75 g de extrato de levedura, 1 g de hidrolizado de caseína, 0,25 g de glicose e adicione 250 mL de água. Aqueça a mistura até a dissolução e filtre. Distribua em tubos de ensaio e autoclave a 121°C, por 15 minutos. Deixe solidificar com os tubos inclina- dos.

Meio para doseamento – Pese 6 g de glicose, 15 g de agar e adicione 1000 mL de água. Aqueça a mistura até dissolução. Distribua em frasco Erlenmeyer de 500 mL e esterilize a 121ºC, durante 15 minutos.

Procedimento – Prepare duas soluções da amostra de tal modo que a mais concentrada tenha no máximo 1 μg/mL e a menos concentrada, no mínimo, 0,5 μg/mL de vitamina B 12. Utilize a solução-tampão de fosfato como diluente. Repique o microrganismo assep- ticamente nos tubos contendo o meio de manutenção do germe. Incube por 24 horas a 37°C. Lave o tubo onde houve crescimento intenso de microrganismos com 5 mL de água estéril para obter uma suspensão do germe que apresente leitura espectrofotomé- trica de 10% de transmitância no comprimento de onda 650 nm. Auxilie a retirada do germe com alça de níquel-cromo até descolamento total das colônias. Funda o meio de doseamento e adicione a solução salina na proporção de 1:3 de meio. Esfrie este meio até a temperatura de (48-50)°C e inocule com a suspensão do germe. Para cada 100 mL de meio preparado, inocule 2 mL de suspensão. Homogeneíze bem e distribua em placas de Petri estéreis (10 a 15 mL por placa). Deixe solidificar. Prepare duas soluções-padrão de vitamina B 12 a partir da solução-padrão estoque de vitamina B 12 de concentrações rigo- rosamente determinadas, semelhantes às concentrações das amostras. Com o auxílio de uma pinça anatômica reta, coloque quatro discos de papel para dosagem de antibiótico na placa preparada e marcada, sendo o primeiro disco na posição do eixo inferior, outro no eixo superior, um à direita e outro à esquerda. Com uma pinça anatômica reta, molhe o disco de papel na solução-padrão de concentração baixa (aproximadamente, 0,5 μg/ mL), eliminando o excesso de líquido com duas batidas rápidas sobre a borda do béquer com a solução. Coloque os discos em todas as placas, na posição inferior do eixo. Em seguida, faça o mesmo procedimento com a solução-padrão de concentração mais alta (aproximadamente 1 μg/mL) na posição superior do eixo. Em seguida, proceda de forma semelhante com a amostra de concentração mais baixa (aproximadamente 0,5 μg/mL). Repita o processo com as soluções das amostras nos discos à direita e à esquerda. Deixe em repouso por 30 minutos à temperatura ambiente antes de incubar a 37°C, por 24 horas. Após o período de incubação, faça a leitura no aparelho medidor de halos.

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Material

Espectrofotômetro de fluorescência, banho-maria, balança analítica, papel de filtro qua- litativo, liqüidificador ou blender , papel indicador de pH, pipetas volumétricas de 1, 2, 5 e 10 mL, pipetas graduadas de 1, 2, 5 e 10 mL, balões volumétricos de 25, 50, 100, 200, 250, 500 e 1000 mL, frascos Erlenmeyer de 125 e 250 mL, béqueres de 25, 100, 200, 250 e 500 mL, provetas de 50, 100 e 200 mL, funil de vidro e pesa-filtro de 25 mL com tampa.

Reagentes

Riboflavina padrão Fluoresceína Ditionito de sódio Sílica gel com indicador de umidade Ácido acético glacial Solução de hidróxido de sódio a 30% m/v Solução de ácido sulfúrico 0,05 M Solução de ácido acético a 5% v/v

Solução de acetato de sódio – Pese 34,5 g de acetato de sódio e dissolva em água. Transfira para balão volumétrico de 100 mL e complete o volume com água.

Solução de diastase – Para a análise de cada amostra, pese 0,3 g de diastase e complete com 5 mL da solução aquosa de acetato de sódio.

Solução de Riboflavina (A) – Pese 25 mg de Vitamina B2, previamente seca em estufa 110°C durante 2 horas. Transfira para um balão volumétrico de 1000 mL com ajuda de 750 mL de água, adicione 1,4 mL de ácido acético glacial, agite e coloque em banho-ma- ria a 50°C até dissolução completa. Complete o volume com água. Guarde em geladeira. (1 mL desta solução contém 25 μg de vitamina B 2 ).

Solução-estoque de fluoresceína (B) – Pese 50 mg de fluoresceína, transfira para um balão volumétrico de 1000 mL com ajuda de 250 mL de água. Adicione 2 mL de solução de hidróxido de sódio a 30%, caso a fluoresceína não seja solúvel. Complete o volume com água. Guarde em geladeira. (1 mL dessa solução contém 50 μg de fluoresceína).

Solução de trabalho de fluoresceína (C) – Faça diluições da solução (B) em um balão volumétrico e complete o volume com água, de modo a obter uma solução aproximada- mente 0,15 μg de fluoresceína por mL.

Fator de correção da solução de trabalho de fluoresceína – Determine o fator de correção da fluoresceína, fazendo algumas diluições de vitamina B 2 (solução A), da seguinte ma-

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neira: pipete 4 mL da solução A e dilua até 100 mL com água. Pipete 10 mL desta nova solução para um balão volumétrico de 100 mL e complete com água (solução D). Um mL desta solução contém 0,1 μg de vitamina B 2. Ajuste o zero do espectrofotômetro de fluorescência usando água e o 100 do aparelho com solução de fluoresceína de trabalho (C). Faça a leitura da solução da vitamina B 2 (solução D), usando a luz de excitação de 440 nm e de emissão de 530 nm.

Calcule o fator de correção usando a fórmula:

L = leitura da riboflavina.

Procedimento

Produtos enriquecidos – Pese uma quantidade suficiente da amostra para obter, na solução final, no máximo 0,1 μg de vitamina B 2 por mL. Adicione 10 mL de solução de ácido acético a 5%, aqueça em banho-maria entre (40-50)°C durante 15 minutos. Esfrie e complete o volume com a solução de ácido acético a 5%. Determine a fluorescência desta solução em espectrofotômetro de fluorescência, usando luz de excitação de 430 nm e de emissão de 530 nm. Acerte o 100 da escala do aparelho com a solução de trabalho de fluoresceína e o zero com água. Após a leitura, adicione aproximadamente 20 mg de ditionito de sódio para a destruição da vitamina B 2. Leia novamente no espectrofotômetro de fluorescência. Considere como leitura da amostra (La), a diferença entre estas duas leituras.

Alimentos naturais – Pese uma quantidade suficiente da amostra, tal que a solução final tenha 0,1 μg de vitamina B 2 por mL. Transfira para um frasco Erlenmeyer de 250 mL, adicione 150 mL de ácido sulfúrico 0,05 M (para amostra de levedura, use água). Misture e deixe em banho-maria à temperatura de ebulição, durante 30 minutos, agitando de vez em quando. Deixe esfriar à temperatura ambiente e adicione 5 mL de suspensão de diastase preparada recentemente. Ajuste o pH na faixa de 4,5 a 5,0, com solução de acetato de sódio e incube a (40–50)°C em banho-maria, durante duas horas. Retire e esfrie à temperatura ambiente, transfira para balão de 100 ou 200 mL e complete o volume com ácido sulfúrico 0,05 M (para levedura, complete com água). Filtre em frasco Erlenmeyer de 125 mL. Faça diluição com solução aquosa de ácido acético a 5% de tal modo que a solução final tenha no máximo 0,1 μg de vitamina B 2 por mL. Determine a fluorescência desta solução em espectrofotômetro usando a luz de excitação 440 nm e emissão de 530 nm. Acerte o 100 da escala do aparelho com a solução de trabalho de fluoresceína e o zero com água. Após a leitura, adicione aproximadamente 20 mg de ditionito de sódio,