UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
JANAINA DUARTE BAUMER
SIANNAH MARIA MAS DIEGO
ESTÁGIO EM DOCÊNCIA
PROF. AGENOR FURIGO JR.
Florianópolis
2008
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APOSTILA - Enzimas, Notas de estudo de Química Industrial
APOSTILA - Enzimas
Tipologia: Notas de estudo
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
JANAINA DUARTE BAUMER
SIANNAH MARIA MAS DIEGO
ESTÁGIO EM DOCÊNCIA
PROF. AGENOR FURIGO JR.
Florianópolis 2008
SUMARIO
- 1.Introdução .............................................................................................................................
- Histórico ..............................................................................................................................
- Propriedades Gerais ..........................................................................................................
- 3.1 A maioria das enzimas são proteínas ...........................................................................
- 3.2 Diferenças entre enzimas e catalisadores químicos .................................................
- 3.3 Nomenclatura das enzimas ............................................................................................
- 3.4 Especificidade ..................................................................................................................
- 3.5 Mecanismo de ação de uma enzima ............................................................................
- Reações Catalisadas por Enzimas...............................................................................
- Fatores que Influenciam a Ação Enzimática
- 5.1 pH.....................................................................................................................................
- 5.2 Temperatura
- 3 Concentração da Enzima
- 5.4 Concentração do Substrato
- Inibição enzimática
- 6.1Inibição Reversível
- 6.2 Inibição Reversível Competitiva
- 6.3 Inibição Reversíve l Não Competitiva
- 6.4 Inibição Irreversível
- Co-fatores e Coenzimas.................................................................................................
- 7.1 As coenzimas devem ser regenaradas
- Regulação da Atividade Enzimática
- Medida de atividade enzimática....................................................................................
- Produção industrial de enzimas
- Referencias Bibliográficas
ácido sulfúrico e cunhou o termo catálise, foi o primeiro a notar que certas substâncias aceleram uma reação.
- 1836 - Theodor Schwann descobre a enzima digestiva Pepsina
- 1860 - Debate: Qual é o papel da levedura no processo de fermentação? Pasteur, em 1860, demonstrou através de uma série de experimentos que a fermentação alcoólica só ocorria em presença de células vivas de levedura. Na mesma época, Liebig defendia que os processos fermentativos eram reações químicas. 1897 - A polêmica foi resolvida. Os irmãos Buchner demonstraram que um extrato de levedura livre de era capaz de fermentar o açúcar do mesmo modo que a célula de levedura. Isto significava que o extrato continha catalisadores da fermentação alcoólica, o que tornava possível estudar “in vitro” reações químicas da fermentação.
- 1878 - William Kuhne propôs que o nome enzima fosse utilizado, a palavra em si significa 'na levedura'.
- 1894 - Primeira produção comercial de alimentos com enzimas. Nos EUA, o bioquímico e líder industrial japonês Dr. Jokichi Takamine começou a produção comercial de koji a partir do fungo Aspergillus.
- 1894 - Cientistas definem a teoria Fechadura e Chave
- 1913 - Michaelis e Lyn descreveu cinética enzimática matematicamente.
- 1914 - É lançado o primeiro detergente compacto
- 1926 - Cientistas descobrem que as enzimas são proteínas
- 1926 – James Summer’s isolou e cristalizou a primeira enzima, a urease.
- A partir 1960 - A evolução no estudo das enzimas, acompanhado por avanços tecnológicos, possibilitou o isolamento e a identificação de propriedades das enzimas. Desde então, vem sendo feita a caracterização e o estudo cinético de milhares de enzimas de diferentes fontes: animais, vegetais e de microrganismos.
- 1986 - A primeira enzima a partir de organismo geneticamente modificado (OGM). 3. Propriedades Gerais
3.1 A maioria das enzimas são proteínas
Com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA que apresentam atividade catalítica, todas as enzimas são proteínas. Proteínas são moléculas compostas por aminoácidos, unidos por ligações peptídicas. Os aminoácidos apresentam em sua fórmula química um grupo carboxílico (-COOH), um grupo amino (-NH2) e um radical R. Os aminoácidos são diferenciados de acordo com o grupo R ligado ao carbono assimétrico. Na natureza, são encontrados 20 aminoácidos. A atividade catalítica das proteínas depende da integridade da sua conformação protéica nativa. Se uma enzima é desnaturada ou dissociada em subunidades, a atividade catalítica geralmente é destruída. Se uma enzima é quebrada em seus aminoácidos constituintes, a sua atividade catalítica é sempre destruída. Assim, a estrutura protéica primária, secundária, terciária e quaternária das enzimas são essenciais para sua atividade catalítica. As enzimas como outras proteínas tem pesos moleculares que variam de cerca de 12.000 até mais de 1 mi lhão.
3.2 Diferenças entre enzimas e catalisadores químicos
As enzimas diferem-se dos catalisadores químicos comuns em vários aspectos:
- Velocidade de reação mais rápida: as velocidades de reações catalisadas por enzimas são tipicamente 106 a 1012 vezes maiores do que as reações correspondentes não catalisadas, e são no mínimo, varias ordens de magnitude maiores do que as mesmas reações catalisadas quimicamente.
- Condições reacionais mais brandas: as reações catalizadas enzimaticamente ocorrem em condições brandas: temperaturas inferiores a 100º C, pressão atmosférica e pH quase neutro. Em contraste, geralmente uma catálise química eficiente requer temperaturas e pressão elevadas, assim como pH extremos.
- Maior especificidade da reação: as enzimas apresentam um grau de especificidade imensamente maior do que os catalisadores químicos em relação a identidade dos seus substratos e dos seus produtos; isto é, as
grupo de classificação principal, a enzima cataliza. Por exemplo a enzima cujo nome recomendado é carboxipeptidase A possui nome sistemático peptidil-L- aminoácido-hidrolase e número de classificação EC 3.4.17.1 (EC é a abreviatura de Enzyme Comission).
Classificação das Enzimas Segundo a Comissão de Enzimas
1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons – Desidrogenases e Oxidases ) 1.1.atuando em CH-OH 1.2.atuando em C=O 1.3.atuando em C=O- 1.4.atuando em CH-NH 2 1.5.atuando em CH-NH- 1.6.atuando em NADH, NADPH
- Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil – Quinases e Transaminases ) 2.1.grupos com um carbono 2.2.grupos aldeído ou cetona 2.3.grupos acil 2.4.grupos glicosil 2.7.grupos fosfatos 2.8.grupos contendo enxôfre
- Hidrolases (reações de hidrólise de ligação covalente - Peptidases ) 3.1.ésteres 3.2.ligações glicosídicas 3.4.ligações peptídicas 3.5.outras ligações C-N 3.6.anidridos ácidos
- Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico – Dehidratases e Descarboxilases ) 4.1. =C=C= 4.2. =C=O 4.3. =C=N-
- Isomerases (reações de interconversão entre isômeros óticos ou geométricos - Epimerases ) 5.1.racemases
- Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré-existentes, sempre às custas de energia - Sintetases ) 6.1. C-O 6.2. C-S 6.3. C-N 6.4. C-C
3.4 Especificidade
Existe uma correlação entre a estrutura das proteínas ou peptídeos que fazem parte da molécula enzimática e suas propriedades biológicas, e esta propriedade leva a uma especificidade extraordinariamente alta e reproduzível. Provavelmente apenas uma fração da molécula, denominada sítio ativo, é a responsável pela ligação da enzima ao substrato ou substratos, e essa fração determinaria a especificidade enzimática. A especificidade das enzimas varia muito de uma enzima para outra, sendo muito baixa para algumas enzimas e muito alta para outras. É chamada especificidade baixa, quando esta relação existe apenas em relação a tipos de ligação, como certas peptidases (ligações peptídicas), fosfatases (ligações fosfato-éster) e estearases (ligações carboxi-éster, podendo-se citar a lipase que hidrolisa as ligações ácido-álcool de quase todos os ésteres orgânicos). A especificidade baixa é mais comumente encontrada em enzimas degradativas, mas é raramente encontrada em enzimas biosintéticas. Um conjunto intermediário de enzimas apresenta especificidade de grupo, como as hexoquinases, que catalisam a fosforilação de uma variedade de açúcares contanto que sejam aldohexoses. A especificidade absoluta, é o tipo de especificidade exclusiva, isto é, quando uma enzima atua somente sobre um determinado composto, como a urease que hidrolisa a uréia, mas nenhum de seus derivados, ou a tripsina, que hidrolisa apenas ligações peptídicas formadas por grupos carboxílicos dos aminoácidos básicos. Esta enzima é de importância extraordinária na determinação da seqüência de aminoácidos em proteínas. Outro aspecto importante da especificidade das enzimas é a sua estereo- especificidade com relação ao substrato. Uma enzima pode ter uma especificidade ótica em relação aos isômeros D e L dos aminoácidos. A maioria das enzimas hidrolisa apenas ligações peptídicas de L-aminoácidos, o que deveria ser esperado, já que as proteínas enzimáticas são constituídas por L-aminoácidos e tem conformações determinadas. As forças não covalentes por meio das quais substratos e outras moléculas se ligam as enzimas são similares em caráter às forcas que regem a conformação
Figura 2: Representação esquemática do modelo do encaixe induzido de Koshland.
A hipótese de Koshland, mais moderna, da “enzima flexível” ou do “encaixe induzido” considera que o sítio ativo não precisa preexistir sob uma forma geométrica rígida, devendo contudo existir um arranjo espacial preciso e específico dos grupamentos R (cadeia lateral) dos aminoácidos, arranjo esse que é induzido pelo contato com o substrato (figura 2). Estudos por raio X indicam que os sítios de ligação aos substratos da maioria das enzimas são, em grande parte, pré-formados, mas sofrem mudanças conformacionais no momento da ligação do substrato (um fenômeno denominado ajuste induzido).
4. Reações Catalisadas por Enzimas
Para reagir, as moléculas presentes em uma solução devem colidir com orientação apropriada e com a quantidade de energia que lhes permitam formar o complexo ativado, denominado estado de transição que representa os reagentes em seu estado ati vado. Para atingir o estado de transição, necessita -se de uma quantidade de energia definida como energia de ativação (E a) ou mais comum em bioquímica energia livre de ativação, ?G+ (o símbolo (+ ) indica o processo de ativação). Sob condições fisiológicas, a velocidade das reações pode ser aumentada pela redução da energia livre de ativação conseguida pela ação de enzimas.
A comparação do perfil energético das reações catalisadas e não- catalisadas é mostrada na Figura 3 para a reação: A + B? C + D No gráfico, o estado de transição corresponde ao ponto de mais alta energia da reação não-catalisada e é a medida da energia livre de ativação, ?G+. Ou ainda, ?G+ é a energia livre do estado de transição subtraída da energia livre dos reagentes. No complexo ativado (estado de transição do sistema), os reagentes estão em forma intermediária de alta energia e não podem ser identificados nem como reagentes nem como produtos. O complexo do estado de transição pode ser decomposto em produtos ou voltar aos reagentes.
Figura 3: diagrama energético de reação catalisada e de reação não catalisada ?G+ = energia livre de ativação. ?G0 = variação de energia livre. A diferença entre os valores da energia de ativação de uma reação catalisada e de uma reação não-catalisada, indica a eficiência do catalisador.
A velocidade de uma reação é inversamente proporcional ao valor de sua energia livre de ativação. Quanto maior o valor de ?G+ , menor será a velocidade da reação. Os catalisadores aumentam a velocidade da reação reduzindo a energia livre de ativação. A velocidade de uma reação pode aumentar na ordem de 10^6 a 10^12 vezes mais do que a reação correspondente não-catalisada.
A temperatura influi na atividade e o ponto ótimo representa o máximo de atividade. A temperaturas baixas, as enzimas encontram-se muito rígidas e quando se supera um valor considerável (maior que 50°C) a atividade cai bruscamente porque, como proteína, a enzima se desnatura. Em geral, os aumentos de temperatura aceleram as reações químicas: a cada 10°C de aumento, a velocidade de reação se duplica. As reações catalisadas por enzimas seguem esta lei geral. Entretanto, sendo proteínas, a partir de certa temperatura, começam a desnaturar-se pelo calor. A temperatura na qual a atividade catalítica é máxima chama-se temperatura ótima. Acima desta temperatura, o aumento de velocidade da reação devido a temperatura é compensado pela perda de atividade catalítica devido a desnaturação térmica, e a atividade enzimática decresce rapidamente até anular-se.
5.3 Concentração da Enzima
A velocidade máxima da reação é uma função da quantidade de enzima disponível. Assim, a velocidade inicial da reação enzimática é diretamente proporcional à concentração de enzima (existindo substrato em excesso) (Figura 4).
Figura 4: Efeito da concentração da enzima sobre a ve locidade inicial (V0). A concentracao do substrato esta acima da necessária para atingir a velocidade máxima.
5.4 Concentração do Substrato
Para atender as necessidades do organismo, as reações bioquímicas devem ocorrer em velocidade compatível. A velocidade de uma reação bioquímica é expressa em termos de formação de produto ou pelo consumo do reagente por unidade de tempo. Inicialmente a velocidade da reação é diretamente proporcional a concentração do reagente A. O processo exibe cinética de primeira ordem (Figura 5). Quando a adição de mais reagente não aumenta a velocidade, a reação exibe cinética de ordem zero (Figura 5). A velocidade passa a ser constante porque não depende mais da concentração dos reagentes, mas de outros fatores. A quantidade de reagente é o suficiente grande para saturar todos os sítios catalíticos das moléculas enzimáticas. Assim, o reagente só existe na forma de complexos enzima-substrato (ES). Como a curva velocidade-substrato é hiperbólica, a fase de ordem zero atinge uma velocidade máxima.
Figura 5: efeito da concentração de substrato sobre a velocidade inicial V0 em reações catalisadas por enzimas.
6. Inibição enzimática
Muitas substâncias alteram a atividade de uma enzima associando reversivelmente a ela, de forma a influenciar a ligação do substrato e/ou seu numero de reciclagem. As substâncias que reduzem a atividade de uma enzima são conhecidas como inibidores. Grande parte do arsenal farmacêutico moderno é constituído por inibidores enzimáticos (Por ex. tratamento da AIDS é
O inibidor não competitivo pode ser uma molécula que não se assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a enzima.
6.4 Inibição Irreversível
A inibição irreversível ocorre quando o inibidor liga-se tão fortemente à enzima que a dissociação é muito lenta. Podem destruir grupos funcionais que são essenciais para a atividade enzimática. A enzima não retoma a sua atividade normal. Ex.: Inibição dos gases neurovenenosos e inseticidas organofosforados na acetilcolinesterase (enzima importante na transmissão dos impulsos nervosos).
7. Co-fatores e Coenzimas
Algumas enzimas como a quimotripsina (enzima que hidrolisa proteína) ou triosefosfato isomerase são ativas sem necessitar a presença de outro fator. No entanto, quase um terço das enzimas conhecidas requerem um componente não protéico para sua atividade, denominado cofator. Os co-fatores podem ser íons metálicos, como o Cu2+, o Fe3+ ou o Zn2+. A natureza essencial de tais co-fatores explica por que razão os organismos necessitam de quantidades diminutas de certos elementos nas suas dietas. Isso também explica, em parte, os efeitos tóxicos de certos metais pesados. Por exemplo, o Cd2+ e o Hg2+ podem substituir o Zn2+ (todos se encontram no mesmo grupo na tabela periódica) nos sítios ativos de certas enzimas, incluindo a RNA-polimerase, tornando, desse modo, essas enzimas inativas. Os co-fatores também podem ser moléculas orgânicas, conhecidas como co-enzimas, tal como o NAD+ na YADH. Alguns co-fatores (p.ex., o NAD+) são apenas temporariamente asssociados com uma dada molécula enzimática, de maneira que elas funcionam como co-substratos. Outros co- fatores, conhecidos como grupos protéticos, estão permanentemente associados com suas proteínas, em geral por meio de ligações covalentes. Por
exemplo, o grupo prostético heme do citocromo c é fortemente ligado a essa proteína por uma extensa rede de interações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio junto com ligações covalentes entre o heme e as cadeias laterais especificas da proteína. Um complexo enzima-co-fator cataliticamente ativo é chamado de holoenzima. A proteína enzimaticamente inativa resultante da remoção do co- fator da holoenzima é chamada de apoenzima; ista é, Apoenzima (inativa) + cofator? holoenzima (ativa)
7.1 As coenzimas devem ser regenaradas
As coenzimas são quimicamente modificadas pelas reações enzimáticas em que participam. Na reação da YADH, por exemplo, o NAD+ é reduzido a NADH. A fim de complementar o ciclo catalítico, a coenzima deve retornar ao seu estado original (no exemplo da YADH, o NADH deve ser reoxidado a NAD+).
8. Regulação da Atividade Enzimática
Um organismo deve poder regular as atividades catalíticas de suas enzimas para que ele possa coordernar seus processos metabólicos, responder às mudanças no meio, crescer e diferenciar-se, tudo de maneira ordenada. Há duas maneiras pelas quais isso pode ocorrer:
- Controle da disponibilidade da enzima. A quantidade de uma dada enzima em uma célula depende da sua velocidade de síntese e da sua velocidade de degradação. Cada uma dessas velocidades é diretamente controlada pela célula e esta sujeita a mudanças drásticas em períodos que vão de minutos (em bactérias) até horas (em organismos superiores).
- Controle da atividade da enzima. A atividade catalítica de uma enzima pode ser diretamente regulada por meio de alterações estruturais que influenciem a afinidade da ligação do substrato à enzima. A afinidade de ligação do substrato a uma enzima pode, de modo semelhante, variar com a ligação de pequenas moléculas, chamadas efetores alostéricos.
fatores podem contribuir para este decréscimo: diminuição da concentração de substrato, inativação parcial da enzima no decorrer da reação, inibição por produto e deslocamento do equilíbrio se a reação for reversível. Para evitar a influencia destes fatores costuma-se associar a atividade á medida da velocidade de reação em condição inicial, ou seja, aquela que assegura velocidade constante. A escolha de um método para a determinação da atividade de uma enzima produzida por fermentação requer conhecimento prévio da faixa de concentração enzimática que permite obter uma variação linear da concentração de produto (ou substrato) com o tempo. Podem ser usados métodos variados para avaliar a acriacao das concentrações das espécies. Alguns deles são muito diretos (espectrofotometria, fluorimetria, titulometria) e outros menos (medida da viscosidade).
10. Produção industrial de enzimas
A produção de enzimas em escala industrial se faz majoritariamente por fermentação submersa, embora nos países orientais haja uma tradição estabelecida de utilização da fermentação semi-sólida. Um dos processos mais importantes prévios à fermentação é o preparo do inoculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada. Decorrido o tempo suficiente, essa cultura é inoculada no fermentador principal. A quantidade de inoculo pode variar de 1 a 10% (p/v) e a produção da enzima pode ser afetada por esse parâmetro.
Fonte As enzimas podem ser obtidas de animais (amilase pancreática, lípase pancreática, pancreatina, pepsina, quimosina), vegetais (a-amilase, ß-amilase, bromelina, ficina, papaína) e microrganismos [a) enzimas amilolíticas: Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae, A.niger, A.flavus, A.awamori; b) glicoseoxidase: A.niger, Penicillium amagasakiense, P.notatum ; c) lactase: Saccharomyces fragilis, Zygosaccharomyces lactis ; d) lípase: A.niger, Rhysopus sp ; e) proteases: B.subtilis, A.oryzae, A.flavus, A.niger, Endothia parasítica, Mucor pusillus.
O processo fermentativo A linhagem microbiana utilizada industrialmente é, em geral, fruto de um longo trabalho de melhoramento e, portanto, sigilosamente protegida. Sendo que os cuidados de estocagem e manutenção são muito importantes para a reprodução dos resultados. Os meios de cultivo são formulados através da utilização de compostos quimicamente conhecidos (meios sintéticos) ou de matérias-primas naturais. Os meios devem conter fontes de carbono e energia, fontes de nitrogênio, substâncias minerais e fatores de crescimento. Os meios de cultivo são, em geral, resultado de um processo de otimização. A influência de certos componentes do meio na produção da enzima-alvo pode ser muito significativa. A composição dos meios de cultivo usados industrialmente também é sigilosamente guardada. A fermentação industrial é conduzida em fermentadores mecanicamente agitados. A produção de enzimas geralmente ocorre em fermentadores com capacidade de 10.000 a 100.000 litros, operados de modo descontinuo (batelada). Tais fermentadores são munidos de camisas ou serpentinas internas para as necessidades de aquecimento e refrigeração e de sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxigênio dissolvido e espuma). As fermentações em batelada para produção de enzimas tem duração da ordem de 30 a a150 horas.
Processo a jusante (downstream) da fermentação As operações que se seguem ao processo fermentativo dependem da localização da enzima de interesse (intra ou extracelular).
Etapas iniciais de separação e concentração No caso de enzimas extracelulares, ao término do processo fermentativo, o caldo é resfriado a cerca de 5°C, para assegurar condições de estabilidade do produto e evitar o crescimento de microrganismos