UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANÁLISE DA FUNÇÃO DOS PROMOTORES DOS GENES
SOD E FEN DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA EM
FUNGOS
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Dezembro de 2008
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Análise da função dos genes SOD e FEN em fungos, Notas de estudo de Biologia
ANÁLISE DA FUNÇÃO DOS PROMOTORES DOS GENES SOD E FEN DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA EM FUNGOS
Tipologia: Notas de estudo
2010
1 / 40
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANÁLISE DA FUNÇÃO DOS PROMOTORES DOS GENES
SOD E FEN DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA EM
FUNGOS
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL
Dezembro de 2008
NOME DO ALUNO:
ANÁLISE DA FUNÇÃO DOS PROMOTORES DOS GENES
SOD E FEN DE MONILIOPHTHORA PERNICIOSA EM
FUNGOS
Monografia apresentada ao Departamento de Ciências Biológicas, Campus Soane Nazaré da Universidade Estadual de santa Cruz como avaliação da disciplina de Estágio supervisionado para obtenção do grau de bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em Ecologia.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Júlio Cezar de Mattos Cascardo
__________________________ _________________________
(Avaliador) (Avaliador)
___________________________________________
Prof. Dr. Júlio Cezar de Mattos Cascardo (Orientador)
Quando os nossos dias se tornarem obscurecidos por
nuvens negras e baixas, quando as nossas noites
forem mais negras do que mil noites. Lembremo-nos,
que no universo a um grande e benigno poder, que é
capaz de abrir caminho onde não há caminho, e de
transformar o ontem sombrio num luminoso amanhã.
Martin Luther King
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais ___________________________________, por todo amor e compreensão sempre. Por terem confiado na minha capacidade de passar pelos obstáculos que viriam.
A meu irmão ______________, que não deixou de acreditar em mim um só momento. As palavras de incentivo e o abraço apertado que me levantaram nos momentos difíceis e o sorriso que me empurrava para frente em cada vitória alcançada.
As minhas avós _________________ pelo exemplo de vida e sabedoria. A meu avô , que não está mais entre nós, mas tenho certeza que lá de cima está me abençoando.
Aos meus tios, em especial minha tia pelo apoio e carinho incondicional
Aos meus primos e primas que compartilharam comigo todos os momentos vividos. Em especial a minha prima ________pelas palavras de conforto e incentivo.
Aos meus amigos da Rua _____________ pelas risadas, horas de conversas na porta de casa, as farofadas e principalmente por torcerem por mim sempre.
A minha, amiga, pelo apoio e dedicação nas etapas da minha vida.
Aos meus colegas de escola, família , jamais esquecerei os lugares por onde passei.
Aos meus colegas de faculdade que com o passar do tempo foram se tornando a
Àqueles professores que além de mestres, foram amigos e incentivadores. Em especialíssimo ao professor Gilson, pela amizade, paciência e dedicação sem igual.
Aos amigos e parceiros do LCT: pela cumplicidade, amizade e companheirismo.
A minha parceirinha pelo amor, amizade, ajuda e incentivo.
A por todo aprendizado, compreensão e amizade.
Ao meu orientador Júlio Cezar de Mattos Cascardo pela oportunidade de trabalho.
Acima de tudo agradeço a DEUS pelo dom da vida, por minha família e por todas as pessoas boas que colocastes em minha vida.
quando, como e em que intensidade os genes serão ativados e a importância desses promotores se dá devido ao ambiente altamente oxidante que o M. perniciosa se encontra durante o processo de infecção da planta. Os promotores MpFen e MpSod foram retirados do vetor de propagação pGEM-T Easy, por meio de enzimas de restrição e inseridos no vetor de expressão pGREG506, dirigindo a ativação da síntese de histidina e no vetor da série pCAMBIA 1381 dirigindo a expressão do gene reporte GUS respectivamente e utilizados na transformação de Saccharomyces cerevisiae e M.perniciosa respectivamente_._ O promotor MpFen mostrou-se ser funcional em S. cerevisiae e o promotor MpSod também mostrou-se funcional no organismo do fungo M. perniciosa, permitindo a abertura de novas perspectivas de estudo da função dos promotores de M. perniciosa em outros tipos de fungo.
Palavras-chave: promotores, Moniliophthora perniciosa , Saccharomyces cerevisiae , MpFen , MpSod
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Diagnóstico de transformação de M. perniciosa com promotor MpFen
Figura 2: Ensaio histoquímico para a atividade do GUS em micélios de M. perniciosa****.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Seqüências de oligonucleotídeos usadas como iniciadores 24
1. INTRODUÇÃO
Definindo gene, pode-se dizer que é uma unidade de informação genética que controla um aspecto específico do fenótipo. É um segmento de DNA que codifica uma seqüência de um produto gênico final, podendo ser um RNA ou uma proteína e o mesmo dirigi e determina cada fase de desenvolvimento das características da espécie. A identificação de genes e as condições para a expressão dos transcritos são necessárias para o entendimento da constituição genética, sendo indispensável, o conhecimento das seqüências completas do gene e das regiões que o controlam.
Informações sobre as seqüências gênicas permitem determinar e/ou analisar a estrutura e a função dos genes, desde que tenham sido identificadas seqüências de DNA responsáveis pela codificação de proteínas (VIDAL, 2006), visto que estas executam as mais variadas funções no organismo, como transporte de nutrientes e metabólitos e catálise de reações biológicas (GRIFFITH et al., 2004).
Os genes possuem elementos regulatórios de DNA denominados promotores, seqüências localizadas na frente de um gene, que permite o controle e a expressão deste. É onde a RNA polimerase, orientada pelo complexo de iniciação, se liga ao DNA para definir o início da transcrição. A regulação da transcrição de um gene é realizada principalmente em regiões chamadas
2. OBJETIVO
A partir da problemática inserida na região com a introdução do fungo M. pernicios,a o projeto genoma tem contribuído desde então para a identificação de genes do fungo e permitindo estudos que podem ser úteis no controle da doença. Assim, o objetivo deste estudo é analisar a estrutura e função dos promotores isolados, a partir do banco de dados do projeto genoma do fitopatógeno, em Saccharomyces cerevisiae e como esses promotores se comportam no próprio Moniliophthora perniciosa por meio de transformação genética, bem como o nível de expressão gênica.
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1.. (^) Moniliophthora perniciosa
O cacau ( Theobroma cacao L.) é a cultura mais importante na região sul da Bahia, que foi gravemente afetada pela epidemia da vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo Monilliophthora perniciosa. Este fungo foi detectado no sul da Bahia no final da década de 1980 (PEREIRA et al, 1989), diminuindo drasticamente a
mecanismos envolvidos nas reações de resistências e de susceptibilidade de plantas à doença (DANGL e JONES, 2001).
As pesquisas desenvolvidas com o fitopatógeno visam ampliar os conhecimentos relacionados à estrutura e função genéticas deste, a fim de obter medidas capazes de controlar a sua disseminação.
Lima et al. (2002) desenvolveram um sistema de transformação para o M. perniciosa baseado na resistência ao antibiótico higromicina, devido às dificuldades encontradas na transformação genética de alguns fungos.
3.2.. Análise de promotores
O gene é a unidade de função, a unidade e informação genética que controla a síntese de uma cadeia polipeptídica ou, em alguns casos, uma molécula de RNA (SNUSTAD et al, 2001). A regulação dos genes é feita em diferentes estágios da expressão gênica. O processo de expressão gênica é regulado por múltiplos pontos incluindo modificações da cromatina, controle da transcrição, splicing, transporte e controle da tradução (MOSSERI et al, 2005).
A compreensão das interações moleculares dirigindo a expressão gênica constitui a base de determinação dos eventos envolvidos na diferenciação e desenvolvimento celular, bem como para definir estratégias de mudança genética de proteínas celulares específicas. Estudos já descritos mostram a complexidade das regiões promotoras do gene, nas quais uma gama de elementos, positivos e negativos, influencia na expressão gênica.
Entre vários métodos de estudos de promotores é evidenciando a análise dos níveis de expressão do RNA, ou seja, genes que tem níveis de expressão similares, seu controle transcricional é também similar, e assim, pode compartilhar um sítio de ligação, considerando que a regulação transcricional causa níveis de expressão similares (MOSSERI et al, 2005).
O promotor é dividido em três regiões: a ‘core promoter’, a ‘proximal promoter’ e a ‘distal promoter’. A primeira se refere à união do complexo pré- iniciação (PIC) e pode dirigir um gene repórter a um nível basal do TSS. A segunda, geralmente contém os principais elementos cis -regulatórios para ativar a expressão do gene repórter. E a terceira, ocorre em íntrons (regiões não codificadoras do DNA) e em regiões downstream, por isso, tem dificultado estudos computacionais dessas regiões já que oferecem seqüências conservadas e/ou seqüências com elementos funcionais de maneira limitada (ZHANG, 2007).
Nas análises de regulação da transcrição é comum o uso de um gene repórter, que codifica para uma proteína com atividade enzimática de fácil de fácil percepção (OKKEMA e KRAUSE, 2005). Isto é essencial para verificar a eficiência da transformação. O método se baseia em ligar a seqüência de DNA em questão num vetor de transformação ideal, antes da região codificadora do gene, formando um gene no qual um possível elemento regulador irá dirigir a expressão do gene reporte. O vetor deve conter além do gene repórter, um gene marcador de seleção, para conferir resistência às células eucariotas.
Entender e conhecer os mecanismos pelos quais os promotores integram os elementos regulatórios é fundamental para a compreensão da regulação transcricional. A identificação e análise de promotores ao longo do genoma são importantes para o nosso entendimento das suas contribuições na regulação transcricional.
A transcrição reflete o estado fisiológico da célula e, portanto, é muito variável às suas necessidades, ela representa a diversidade e a complexidade da expressão dos genes inseridos em um determinado genoma (ZAHA, 2003).
Dessa forma, é de grande importância o seqüenciamento do genoma do fungo Moniliophthora perniciosa, avaliando a função dos promotores, a fim de entender os mecanismos de sua regulação transcricional envolvidos na interação cacau: Moniliophthora.
3.3.. Saccharomyces cerevisiae