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APLICACIONES ADICIONALES DE LOS MICROORGANISMOS EN LA
INDUSTRIA FARMACÉUTICA
Entre los usos más importantes de los microorganismos en la industria farmacéutica se encuentra la producción de antibióticos, vacunas y el uso de microorganismos en las nuevas industrias derivadas del DNA recombinante. Sin embargo, existen además una variedad de productos derivados de los microorganismos tales como vitaminas, aminoácidos, dextranos, agentes quelantes de hierro y enzimas.
1. Producción de compuestos farmacéuticos por microorganismos 1.1. Dextranos 1.2. Vitaminas, aminoácidos y ácidos orgánicos 1.3. Agentes quelantes de hierro 1.4. Enzimas 2. Síntesis parcial de compuestos farmacéuticos 2.1. Bioconversión de Esteroides 2.2. Microorganismos inmovilizados en la producción de fármacos 3. Uso de los microorganismos y sus productos en ensayos diversos 3.1. Bioensayos de vitaminas y aminoácidos 3.2. Fenilcetonuria 3.3. Bioensayos de agentes mutagénicos y carcinogénicos 3.4. Uso de enzimas microbianas en el control de esterilidad 3.5. Tecnologías con enzimas inmovilizadas. **4. Uso de microorganismos como modelos del metabolismo de drogas en mamíferos
- Microorganismos como terapia** 5.1 Bacteriofagos 5.2. Probióticos 5.3. Toxinas: Toxina Botulínica 6. Bioinsecticidas
1- PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS DE INTERÉS FARMACÉUTICO
1.1. Dextranos Los dextranos son polisacáridos producidos por bacterias del ácido láctico del género Leuconostoc ( L. dextranicus, L. mesenteroides) al crecer en un medio conteniendo sacarosa. El dextrano es un polímero de glucosa consistente de uniones (1 6) de elevado peso molecular (PM) (15.000 a 20.000.000) (Figura 1)
Figura 1. Estructura del dextrano, mostrando las uniones 1 6
La reacción se efectúa en grandes fermentadores con medios de cultivo que poseen un alto contenido en carbohidratos pero un bajo contenido en N, con una elevada relación C/N. El aspecto más importante es el PM del dextrano a obtener, ya que los dextranos de uso clínico deben tener un peso molecular definido. El PM depende del proceso de hidrólisis del polímero obtenido y del proceso fermentativo (uso de templetes de dextrano, o sea el agregado de dextranos preformados)
Usos: Los dextranos se utilizan comercialmente como sustitutos de plasma o expansores de plasma, los cuales pueden ser administrados vía inyección intravenosa para mantener o recuperar el volumen sanguíneo (deben tener un PM entre 40.000 =220 unidades de glucosa y 300.000). También se pueden usar en úlceras o heridas por quemaduras formando una capa hidrofílica que absorbe exudados. Además poseen amplio uso los derivados de dextrano tales como el hierro-dextrano (con PM de 5.000 a 7.000) para tratar casos de anemia por deficiencia de hierro. El dextrano-sulfato de sodio tiene propiedades anticoagulantes comparables a heparina y se formula para inyecciones por vía intravenosa.
Tabla 2. Ejemplos de vitaminas, aminoácidos, antibióticos, y ácidos orgánicos producidos por microorganismos. Producto farmacéutico Microorganismo Usos
Riboflavina Eremothecium asbyii, Ashbya gossypii Tratamiento en deficiencia de Vit B 2
Cianocobalamina Propionibacterium freudenreichii, P. shermanii, Pseudomonas denitrificans
Tratamiento de la anemia perniciosa
Glutamato/lisina Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum
Suplemento alimenticio, constituyente de liq. intravenosos Ac. Cítrico Aspergillus niger Prod. efervescentes, anticoagulante (citrato de Na), cistitis (cit de K)
Ac. láctico Lactobacillus delbrueckii, Rhizopus oryzae Lactato de Ca (Fte de Ca
+2 , vía oral), soluciones de diálisis
Ac. glucónico Gluconobacter suboxydans, A. niger (^) Adminstraciópn oral de Ca+2 , solubilización de otras drogas (ej. Clorhexidina)
1.3. Agentes quelantes de hierro
El desarrollo de microorganismos en medios de cultivo deficientes en hierro induce la secreción por parte del microorganismo de agentes quelantes de hierro de bajo PM llamados sideróforos que son generalmente derivados del fenol o hidroxamato. El potencial terapéutico de estos compuestos ha generado considerable interés en años recientes, especialmente en casos de envenenamiento con sales de hierro en niños. Por ejemplo el consumo accidental de 3g de FeSO 4 puede producir en un niño pequeño, acidosis, falla cardiaca, coma y otros síntomas; de tal manera que si no es tratado rápidamente esta condición conduce a la muerte. La desferrioxamina B , un sideróforo producido por Streptomyces pilosus es un antídoto altamente efectivo para el tratamiento de envenenamiento severo con hierro. Desferrioxamina se comercializa con el nombre de desferal y su efectividad se debe a dos razones:
- Gran afinidad por ión férrico. Caracterizada por constante de afinidad, Ka =10^30
- El complejo Fe-desferrioxamina es altamente soluble en agua y fácilmente eliminado por riñón.
Estructura de desferrioxamina (desferal) y su correspondiente quelato de hierro es la siguiente:
Usos: Desferal junto con transfusiones de sangre es utilizado en casos de anemias hemolíticas para mantener los niveles normales de hierro libre y hemoglobina. Desferal se prepara como polvo estéril para ser administrado como inyectable. También se puede administrar oralmente en casos de envenenamiento agudo para absorber hierro no absorbido desde el intestino. Recientemente se ha comenzado a usar este tipo de compuestos como agentes antimicrobianos y en la quimioterapia anticancerosa. Estas aplicaciones se fundamentan en el hecho de que el sideróforo pueda hacer que el hierro no esté disponible para el crecimiento microbiano y células neoplásicas, pero que si esté disponible para el organismo. Se han encontrado resultados interesantes, como por ejemplo, los sideróforos bacterianos parabactin y el compuesto II secretado por Paracoccus denitrificans se ha observado que inhiben el crecimiento celular de células leucémicas en cultivo y animales de experimentación. Además parecen ser capaces de inhibir la replicación de virus RNA.
1.4. Enzimas microbianas de uso terapéutico Las enzimas microbianas se uso terapéutico son: a) Estreptoquinasa - Estreptodornasa
En humanos, investigaciones preliminares de pacientes con leucemia aguda mielocítica han demostrado que el tratamiento combinado de neuraminidasas y la quimioterapia convencional pueden incrementar las velocidades de remisión de los tumores.
d) -Lactamasas La aplicación terapéutica de beta-lactamasas se emplea en el tratamiento de pacientes que presentan síntomas de una severa reacción alérgica a posteriori de la administración de penicilina beta-lactamasa sensible. En tales casos se administra intramuscularmente o intravenosamente una penicilinasa (beta-lactamasa) altamente purificada obtenida desde Bacillus cereus , en combinación con otros medicamentos tales como adrenalina o antihistamínicos.
2- APLICACIONES DE MICROORGANISMOS EN LA SÍNTESIS PARCIAL DE
COMPUESTOS FARMACÉUTICOS.
2.1. Bioconversión de Esteroides
El potencial de los microorganismos como catalizadores químicos , se visualizó en su aplicación para la síntesis de importantes esteroides de uso industrial. Además se demostró que ciertos esteroides tales como hidrocortisona poseían actividad antiinflamatoria y que los derivados de las hormonas sexuales ( testosterona y estradiol ) eran útiles como agentes anticonceptivos orales. Puesto que las hormonas esteroidales sólo pueden ser obtenidas de mamíferos en forma directa en muy pequeñas cantidades, se iniciaron estudios tendientes a sintetizarlos desde esteroles de plantas , los cuales pueden ser obtenidos en grandes cantidades y en forma económica. Todos los esteroides adrenocorticales están caracterizados por la presencia de un átomo de O en la posición 11 del núcleo esteroide, el cual es crucial en la determinación de la actividad biológica de la molécula. Aunque es fácil de hidroxilar un compuesto esteroidal por vía química es extremadamente difícil obtener hidroxilaciones sitio-específicas , o sea dirigidas, y para lograrlo es necesario efectuar un gran número de etapas largas y complejas y consecuentemente muy caras. Por ejemplo para sintetizar cortisona se requerían 37 etapas muchas de ellas bajo
condiciones extremas. Este problema fue superado cuando se descubrió que muchos microorganismos son capaces de realizar oxidaciones limitadas con ambas propiedades: estéreo-especificidad y sitio-especificidad. Por lo tanto por la simple adición de un esteroide a cultivos en crecimiento activo del microorganismo adecuado o de células ya desarrolladas denominadas resting-cells se pueden introducir cambios químicos sitio-dirigidos en la molécula. En el año 1952, se introdujo por primera vez el proceso comercial para efectuar la conversión de progesterona a 11 -hidroxiprogesterona por el hongo Rhizopus nigricans
La progesterona es un intermediario inicial en la síntesis de cortisona e hidroxicortisona. Por medio de esta hidroxilación la síntesis fue acortada desde 37 etapas a 11 y el precio se redujo de 200 U$S/g a 6 U$S/g (33 veces). Otras reacciones importantes en la manufactura de esteroides son las deshidrogenaciones (eliminación de dos átomos de hidrógeno del anillo esteroide). Las conversiones microbianas de esteoides más importantes se muestran en la Tabla 3.
Otros esteroides comercialmente importantes incluyen además de cortisona e hidrocortisona al prednisona, el andrógeno testosterona y el estrógeno estradiol ambos empleados como anticonceptivos y a espironolactona utilizado como diurético.
Tabla 3. Ejemplos de transformaciones biológicas de esteroides
El uso de células inmovilizadas presenta las siguientes ventajas respecto de cultivos homogéneos en suspensión.
Ventajas:
- Retención del biocatalizador, aspecto que asegura la máxima productividad, ya que se puede operar bajo condiciones óptimas durante todo el periodo de vida útil de las células, en contraste que la prematura pérdida del mismo en sistemas homogéneos suspendidos.
- Reducción de los requerimientos nutricionales y de medio de cultivo.
- Permite el uso de altas concentraciones de biocatalizador.
- Reducción de los riesgos de contaminación.
- Reducción de los costos de separación del producto y reciclo celular.
- Posibilidad de desacoplar la fase de crecimiento de la fase de producción.
Desventajas:
- Mayores resistencias a la transferencia de masa que los sistemas homogéneos.
- Rotura del soporte matríz por liberación de metabolitos gaseosos como el CO 2.
- Alto costo de algunos soportes.
Entre los soportes más comúnmente usados se encuentran: alginato de calcio, poliacrilamida, carregenina y antracita.
Usos: Los sistemas con organismos inmovilizados han tenido bastante éxito en la síntesis parcial de esteroides y antibióticos (producción de 6-APA) y en la producción del compuesto antiviral adenin-arabinósido por transglicosilación mediante la reacción: uracil-arabinosido + adenina adenin-arabinósido + uracilo Reacción que se produce durante un periodo de 30 días a 60 ºC. Condiciones imposibles de mantener con cultivos en suspensiones homogéneas.
Inmovilización de células en esferas de alginato de calcio Se adiciona una suspensión de células microbianas con una concentración de 10^9 cel/ml mezcladas con alginato de sodio al 1,5-2 % a una solución de CaCl 2 0,1 M desde una altura
de aproximadamente 10 cm para formar pellets celulares , es decir células inmovilizadas en alginato de calcio. La suspensión celular en alginato de sodio se adiciona por medio de una jeringa con una aguja en la punta de tal manera de efectuar el agregado en forma de gotas discretas y no como un chorro continuo permitiendo de esta manera la formación de los pellets (Figura 2). Luego los pellets son empaquetados en una columna para su uso. En dicha columna se efectúa el bombeo en contracorriente del medio de alimentación conteniendo la droga a biotransformar, cuando el proceso finaliza, se colecta el producto transformado (Figura 3)
Figura 2. Inmovilización de células en esferas de alginato
3. USO DE MICROORGANISMOS Y SUS PRODUCTOS EN BIOENSAYOS
Los microorganismos han sido utilizados en diversos bioensayos para:
- determinar la concentración de compuestos (ej, amino ácidos, vitaminas y algunos antibióticos) en mezclas químicas complejas o fluidos corporales
- diagnóstido de enfermedades
Figura 3. Biorreactor con células bacterianas inmovilizadas en alginato de calcio
presencia de PA o PPVA. El uso de discos de papel de filtro impregnados con sangre u orina permiten la detección de niveles elevados de PA o PPVA. El ensayo puede ser cuantificado midiendo el diámetro de la zona de crecimiento alrededor del disco de papel de filtro y compararlo con una curva de calibración construida a partir de concentraciones conocidas de PA o PPVA. En caso positivo la prueba de Guthrie provee evidencia presuntiva de presencia de PKU que luego debe confirmarse por algún otro medio. Aunque esta prueba aun se utiliza, está siendo progresivamente reemplazada por las modernas técnicas genéticas.
3.3. Ensayo de carcinógenos y mutágenos Un carcinógeno es una sustancia que provoca carcinogénesis en los tejidos vivos, por ej, la producción de un tumor maligno. Un mutágeno es un agente químico o físico que induce mutación en células humanas u otras. Los ensayos de mutagenicidad son usados para probar la habilidad de una variedad de sustancias químicas para producir mutación en el ADN de la célula. Tales mutaciones ocurren tanto a) a nivel de un gen (mutación puntual) de cromosomas individuales o b) a nivel del juego de cromosomas, por ej. cambio en el número de cromosomas. Algunos compuestos solo son mutagénicos o carcinogénico luego del metabolismo (a menudo del hígado). Por lo tanto, este aspecto debe ser considerado al diseñar un método adecuado para evaluar tales agentes.
a) Mutaciones a nivel de gen Una mutación hace referencia a un cambio del organismo salvaje a uno más estricto. Por el contrario una mutación reversa es la vuelta del mutante a la forma salvaje, es decir, es un cambio heredable en un gen mutado previamente que se restaura a la función original del gen. Existen dos tipos de mutación reversa, corrimiento del marco de lectura o mutación puntual (ya vistos) b) Prueba de Ames Los principios de la mutación reversa son utilizados en la Prueba de Ames para detectar compuestos químicos que actúan como mutágenos o carcinógenos. Permite examinar un gran número de compuestos en forma rápida a través de su habilidad para inducir mutagénesis (vista en MGyF- Parte A)
3.4. Uso de enzimas microbianas para pruebas de esterilidad En las preparaciones farmacéuticas estériles se debe descartar presencia de contaminación por hongos o bacteriana antes de su uso. Si la preparación contiene un antibiótico este debe ser removido o inactivado, para lo que generalmente se emplean membranas de filtración. Sin embargo, esta técnica tiene ciertas desventajas que incluyen contaminación accidental o retención del antibiótico en el filtro y su liberación en el medio de cultivo. Una solución a este problema es la inactivación enzimática del antibiótico. Actualmente, el único método permitido por la Farmacopea es el uso de una betalactamasa adecuada para inactivar penicilinas y cefalosporinas. Otros antibióticos susceptibles de inactivación enzimática son cloranfenicol y aminoglucósidos.
3.5. Tecnología de enzimas inmovilizadas Se ha discutido el uso terapéutico de enzimas microbianas, además las enzimas forman las bases de distintas pruebas diagnósticas usadas en medicina clínica. Por ejemplo, glucosa oxidasa, una enzima usada en el análisis de glucosa en sangre, se obtiene comercialmente de Aspergillus niger. Aunque las tiras para determinación de glucosa se han refinado, el principio sigue siendo el mismo. La glucosa oxidasa se coloca entre una membrana de policarbonato y una de acetato de celulosa. Cuando se aplica un volumen de sangre de un pinchazo, la membrana de policarbonato permite la difusión de la glucosa en el sandwhich pero limita la entrada de moléculas más grandes reduciendo los contaminantes de fondo. La enzima oxida la glucosa, resultando en la formación de peróxido de hidrógeno que difunde a través de la membrana de celulosa y es medido amperometricamente siguiendo la interacción con un electrodo de platino. Recientemente se han desarrollado en forma experimental, diferentes tipos de electrodos para glucosa oxidasa implantables para monitorear los niveles de glucosa sanguínea de pacientes diabéticos. Aunque todavía existen desafíos relativos a la inactivación in vivo de la enzima, la calibración de la glucosa y la respuesta inmune, se sigue avanzando en las investigaciones en esta área. La FDA aprobó un sensor subcutáneo inalámbrico que monitorea continuamente los niveles de glucosa sanguínea durante 7 días. Probablemente, los biosensores que emplean enzimas inmovilizadas útiles para el monitoreo de diversas sustancias de importancia clínica estarán rápidamente disponibles en un futuro no muy lejano.
junto con los 10-hidroxi y N-óxido derivados. Mediante la ampliación de este procedimiento, pueden obtenerse cantidades significativas de las sustancias intermedias que se forman durante el metabolismo de los mamíferos.
5. MICROORGANISMOS COMO TERAPIA
5.1 Bacteriofagos
En 1900 se observó que los pacientes con altos títulos de bacteriófagos en sus heces se recuperaban de la disentería y fiebre tifoidea más rápidamente. Esto allanó el camino para la comercialización de preparaciones de bacteriófagos para una variedad de infecciones bacterianas.Tras el advenimiento de la moderna terapia con antibióticos en los años treinta, la ciencia de la terapia fágica fue casi un fracaso, pero el surgimiento de la resistencia a los antibióticos ha dado lugar a un resurgimiento en el interés por la investigación y el desarrollo de fagos terapéuticos, y al menos ocho empresas comerciales están involucradas en el desarrollo de fármacos fagos clínicamente relevantes. La mayoría de los fagos tienen una afinidad específica sólo para un pequeño grupo de bacterias, determinado por la interacción de los componentes del fago con los receptores de superficie bacteriana. Tras la interacción, el ADN viral es trasladado a la célula bacteriana para la transcripción donde puede producirse la replicación lítica o lisogénica. Los fagos líticos son en muchos sentidos un agente antibacteriano ideal. Son específicos para el objetivo y la existencia de más de 1×10^8 especies de fagos sugiere que puede haber un fago terapéutico para cada especie bacteriana; matan bacterias rápidamente y se amplifican en el sitio de la infección, y son relativamente baratos de producir. Además, la FDA reconoce que los seres humanos ingieren grandes cantidades de fagos en su dieta diaria y tácitamente acepta que son seguros para la administración oral. Sin embargo, la administración tópica es quizás la que ha tenido más interés, con la aplicación de mezclas de fagos a heridas crónicas ya sea como simples suspensiones o incorporadas en alguna forma de sistema de vendaje tal como un polímero biodegradable infundido con fagos y antibióticos. La administración sistémica de la terapia fágica se complica por un conocimiento inadecuado de las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la mayoría de las especies de fagos, con muchos estudios que indican que el momento de administración es crítico para el control de la infección.
Informes recientes sugieren, que los fagos, inmunoestimuladores naturales, pueden ser útiles como vehículos de administración de vacunas ya sea vacunando con fagos que exhiben el antígeno o utilizando fagos para entregar un casete de expresión de ADN integrado en el genoma del fago.
5.2. Probióticos La microflora bacteriana que coloniza el tracto gastro intestinal es una característica esencial de la fisiología de un ser humano normal y representa una relación simbiótica donde la bacteria protege al huésped contra microorganismos patógenos y además ayuda en la digestión de los alimentos contribuyendo a la producción de nutrientes esenciales para el huésped. Bajo ciertas condiciones, como por ejemplo, tratamiento con antibióticos, la población bacteriana del tracto gastrointestinal puede disminuir contribuyendo a estados de enfermedad. Los probióticos son cultivos vivos de 'buenas' bacterias que se supone que sobreviven al tránsito a través del estómago, subsecuentemente colonizando la mucosa intestinal y reemplazando la microflora natural disminuída o desplazando los microorganismos patógenos. Las bacterias más comúnmente encontradas como probióticos, son Bifidobacteria y Lactobacillus spp. principalmente porque son capaces de resistir las condiciones desfavorables del tracto superior. Bifidobacteria spp. están entre los primeros colonizadores del intestino del neonato y contribuye a la defensa de invasores patógenos y a la maduración del sistema inmune. Los probióticos son formulados, generalmente en cápsulas o como suplementos dietarios, particularmente en productos de consumo diario como el yogurt. A menudo la formulación se combina con prebióticos (oligosacáridos indigeribles que son fermentados por bacterias anaerobias en el intestino produciendo sustratos metabólicos que promueven el crecimiento de probióticos. Sin embargo, los probióticos se comercializan cada vez más como un nutriente para los individuos sanos para promover la salud del tracto gastro intestinal e inmune, a pesar de la evidencia de que los efectos no son significativos.
5.3. Toxinas: Toxina Botulínica A finales del siglo XIX, se identificó una potente exotoxina producida por la bacteria anaerobia Gram positiva Clostridium botulinum como la causa de un brote mortal por intoxicación alimentaria. Los síntomas del botulismo incluyen trastornos del tracto gastrointestinal, disfagia, parálisis facial y, dependiendo de la dosis ingerida, debilidad
químicos. Sin embargo, cualquier microorganismo utilizado en este sentido debe ser altamente virulento, específico para la peste blanco, pero no patógeno para animales, humanos o plantas. Debe ser económico de producir, estable en su almacenamiento y preferentemente de rápida acción. Los patógenos virales y bacterianos han mostrado ser los más promisorios. Tal vez, el mejor estudiado, disponibles comercialmente es el B. thuringiensis. Este patógeno contiene 2 toxinas de principal importancia. La δ-endotoxina es una proteína presente dentro de la célula como una inclusión cristalina dentro de un estuche de esporas. La toxina es primariamente activa contra las larvas de insectos lepidópteros (mariposas y polillas). Las preparaciones disponibles comercialmente de B. thuringiensis son esporas preparadas como polvos, se utilizan para proteger los cultivos de la destrucción por las orugas y son no-tóxicos para humanos y animales. Aunque posee un espectro de actividad pequeño, se aisló una variante de B. thuringiensis que produce diferentes δ – endotoxinas con actividad contra los insectos coleópteros (escarabajos) más que sobre los lepidopteros o dípteros (moscas y mosquitos). La segunda toxina de B. thuringiensis, una β - exotoxina, posee un espectro de acción mucho más amplio. Sin embargo, este compuesto es tóxico cuando se administra a mamíferos por lo que las preparaciones comerciales de la δ – endotoxina de B. thuringiensis es obtenida de cepas que no producen β - exotoxin. Otros insectos patógenos han sido evaluados por su actividad contra insectos que son vectores de enfermedades como tripaniosomiasis, asi como las que causan daño a los granos.
Extraído y traducido de: Smith MW, Birchall JC, Coulman SA.(2011). Capítulo 26: The wider contribution of microbiology to the pharmaceutical sciences. En: Hugo & Russell´s. Pharmaceutical Microbiology. 8° Ed. Denyer SP, Hodges N, Gorman SP, Gilmore B (editores)
