TECNICAS DE BIOLOGÍA MOLÉCULAR, Diapositivas de Bioquímica Médica

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Análisis de Ácidos Nucleicos

Tipos de muestras

• (^) Tejidos
• (^) Células embrionarias
• (^) Líquido amniótico
• (^) Células sanguíneas
• (^) Muestras de medula ósea
• (^) Semen
• (^) Líquido cefalorraquídeo
• (^) Líquido articular
• (^) Etc.

Disociación de la muestra tisular

• (^) Fragmentación mecánica. Trituración de la muestra en una disolución amortiguadora
• (^) Digestión química. Homogenización isotónica en presencia de detergentes. La eliminación de cationes divalentes Ca 2+ , también desensibiliza la adhesión de células entre si y con la matriz extracelular
• (^) Digestión enzimática.

Purificación de los ácidos

nucleicos

• (^) Uso de enzimas que degradan específicamente un tipo de molécula: proteasas, DNAasas y RNAasas
• (^) Detergentes para la desnaturalización de proteínas o compuestos con actividad caotrópica por ejemplo urea, cloruro de guanidilo y tiocinato de guanidilo.
• (^) Acción diferencial del medio alcalino sobre el DNA y RNA EL DNA en medio alcalino solo se desnaturaliza El RNA en medio alcalino se hidroliza rindiendo oligonucleótidos y nucleótidos libres
• (^) La escasa solubilidad en alcoholes de los ácidos nucleicos permite su precipitación es este medio.

Análisis de Ácidos Nucleicos

Hibridación

Desnaturalización

temperatura pH formamida urea guanidinio

Temperatura de Fusión

• (^) La temperatura de fusión describe la estabilidad de un DNA en una solución dada
• (^) Es una función de los siguientes parámetros
  • (^) internos (de la molécula)
    • (^) tamaño de la molécula
    • (^) % (G + C)
    • (^) concentración de la molécula
  • (^) externos (del ambiente)
    • (^) concentración de sales
    • (^) pH
    • (^) otros agentes

Factores de hibridación

• (^) Concentración de DNA o RNA diana (número de copias que contiene la muestra)
• (^) Concentración y tamaño de la sonda
• (^) Temperatura y tiempo de hibridación
• (^) Características del medio de reacción: fuerza iónica, pH, concentración de agentes desnaturalizantes
• (^) Los cationes monovalentes (Na+) estabilizan la estructura bicatenaria, apantallan la repulsión la repulsión electrostática entre los grupos fosfato facilitando la aproximación de ambas hebras.

Rigor de hibridación

Hibridación condiciones rigurosas Temperatura alta 42 ºC, concentración alta de formamida, concentración baja de NaCl

Hibridación in situ tisular

• (^) Localización de ácidos nucleicos en tejidos La detección se realiza por autorradio grafía y examen de la película fotográfica bajo el microscopio o por microscopia de fluorescencia.

Hibridación in situ en células

• (^) Localización de ácidos nucleicos en células

HPV

FISH

• (^) Siglas en Inglés:
  • (^) F luorescence
  • (^) i n s itu
  • (^) H ybridization Hibridación in situ con sondas fluorescentes

Fluorescencia

Microscopio de

epifluorescencia

• (^) Koehler, Reichert y Lehman - (^) desarrollo del microscopio de fluorescencia