¡Descarga Práctica 12 biotecnología- aislamiento de núcleos y más Apuntes en PDF de Biotecnología solo en Docsity!
Práctica 1 2. AISLAMIENTO DE NÚCLEOS. ALMACENAMIENTO Y FUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA. Julia Mendez, Arath Quiroz, Melissa González, Maximiliano Vega. Asignatura: Introducción a las ciencias biotecnológicas. Licenciatura QFBT. Fecha de entrega: 17 /06//. Docente: Abril Ivett Priscilla Gómez Guzmán. RESUMEN : Para esta práctica se necesitó de hojas de espinaca. Estas con el fin de someterlas a centrifugación y así lograr la separación de los núcleos en esta célula vegetal.Se colocaron 25 ml de amortiguador de fosfatos junto con las hojas para la lísis , se filtró con ayuda de una gasa aprox. 10 ml recuperados. Se realizó la primera centrifugación - 600 g. 5min.Se retiró el sobrenadante y se mantuvo la pastilla (núcelos) esta se re suspende en 5 ml de sacarosa al 5% disuelta en amortiguador de F. Se colocaron 3ml de la fracción anterior en el gradiente de sacarosa 80,30.10.Se realizó la segunda centrifugación 500 g. 15 min. Se retiran las bandas de el gradiente de sacarosa y se colocan en tubos Eppendorf 1.5 ml.Se agrega 1 ml de amortiguador de F y se mezcló. La tercera centrifugación - pastilla de 1000 grav ,5min. Se retira sobrenadante y se colocan 5 ml de amortiguador F a 1000 grav. Se incubaron las muestras en congeladores y se pausó la práctia. Retomando, se sacaron de los congeladores 1 semana después. Se re suspende la pastilla ( temp.ambiente) en 1000 ul de amortiguador de F. En tubos Eppendorf 200 ul de núcleos re suspendidos en 400 ul de :Azul de metileno , eosina , y sudán iv(200 microlitros) y se mezcló ;se realizaron frotis previamente fijados con calor en una lámpara de alcohol y se vertieron gotas de agua destilada para retirar el colorante y se observó al microscopio logrando identificar los núcleos. ALABRAS CLAVE : Célula, núcleo, centrifugación, célula vegetal , separación, tinción.
INTRODUCCIÓN :
La célula es el componente básico de todos los seres vivos. células. Le brindan estructura al cuerpo, absorben los nutrientes de los alimentos, convierten estos nutrientes en energía y realizan funciones especializadas. Contienen el material hereditario del organismo y pueden hacer copias de sí mismas. Constan de partes, cada una con una función diferente. Algunas de estas partes, llamadas orgánulos, son estructuras especializadas que realizan ciertas tareas dentro de la célula. Las células humanas contienen las siguientes partes principales: Citoplasma Dentro de las células, el citoplasma está formado por un líquido gelatinoso (llamado citosol) y otras estructuras que rodean el núcleo. Citoesqueleto El citoesqueleto es una red de fibras largas que forman el marco estructural de la célula. El citoesqueleto tiene varias funciones críticas, incluyendo determinar la forma celular, participar en la división celular y permitir que las células se muevan. También brinda un sistema similar a una vía que dirige el movimiento de orgánulos y otras sustancias dentro de las células. Retículo endoplásmico Este orgánulo ayuda a procesar las moléculas creadas por la célula. Además, RE transporta estas moléculas a sus destinos específicos, ya sea dentro o fuera de la célula. Aparato de Golgi El AG empaqueta las moléculas procesadas por el retículo endoplásmico para ser transportadas fuera de la célula. Lisosomas y peroxisomas Centro de reciclaje de la célula. Digieren bacterias extrañas que invaden la célula, eliminan las sustancias tóxicas y reciclan sus componentes celulares gastados. Mitocondrias Orgánulos complejos que convierten la energía de los alimentos para que la célula la pueda usar. Tienen su propio material genético, separado del ADN del núcleo, y pueden hacer copias de sí mismas. Núcleo Sirve como centro de comando de la célula, enviando instrucciones a la célula para que crezca, madure, se divida o muera. También alberga ADN (ácido desoxirribonucleico), el material hereditario de la célula. El núcleo está rodeado por una membrana llamada envoltura nuclear, la que protege el ADN y separa el núcleo del resto de la célula. Membrana celular Revestimiento exterior de la célula. Separa la célula de su entorno y permite que los materiales entren y salgan de ella. Ribosomas Orgánulos que procesan las instrucciones genéticas de la célula para crear proteínas. Estos orgánulos pueden flotar libremente en el citoplasma o estar conectados al retículo endoplásmico (ver arriba). (s/f). Medlineplus.gov. PLANTAS: Las plantas son organismos pluricelulares formadas por miles de células vegetales especializadas en diferentes funciones. Páez, J. C. (2021, febrero 26) CÉLULA VEGETAL: Células eucariotas (células con núcleo verdadero)se van dividiendo y diferenciando a lo largo del desarrollo de las plantas. En su interior ocurre la fotosíntesis. Células del parénquima :Tejido principal de los tejidos vegetales y las células que lo componen se denominan células parenquimáticas. Son las estructuras celulares más abundantes en
un sobrenadante y un material sedimentado. Centrifugación mediante un gradiente de densidades: Este tipo de centrifugación es un proceso mediante el cual las partículas se distribuyen en fracciones de diferentes densidades de un fluido líquido. El método es un poco más elaborado que la centrifugación diferencial, no obstante presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. La técnica permite la separación de varios o todos los componentes de la muestra y la realización de medidas analíticas. El método de gradiente de densidades implica la utilización de un soporte fluido cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular, de tal manera que la muestra a analizar pueda ser suspendida en la solución resultante. Como solutos se utilizan la sacarosa, polisacáridos sintéticos, derivados yodados del ácido benzoico, o sales de metales alcalinos pesados como el rubidio o el cesio, entre otros. La muestra se deposita en la parte superior del gradiente como una fina banda y, tras centrifugar, la separación de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas que pueden ser separadas (o fraccionadas). Centrifugación zonal En la centrifugación zonal la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidades previamente formado. A causa de la fuerza centrífuga las partículas se mueven a velocidades que dependen de la masa y sedimentan en diferentes zonas del gradiente. La densidad máxima del gradiente no ha de exceder a la de las partículas a separar. Centrifugación isopícnica La centrifugación isopícnica separa les partículas en un gradiente de densidades en función de la densidad de las mismas. Las partículas se mueven en el gradiente hasta que llegan a un punto donde la densidad de éstas i la del gradiente son idénticas (de aquí el nombre de ‘isopícnico’). En este caso, es condición fundamental que la densidad máxima del gradiente final ha de exceder siempre a la densidad de las partículas. Por este motivo la sedimentación final no se produce si se controlan las condiciones de centrifugación, ya que las partículas flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior a la de éstas. Esta técnica se utiliza, por ejemplo, para separar partículas similares en tamaño pero de diferente densidad. En este sentido, la centrifugación isopícnica es un método adecuado para separar ácidos nucleicos o diferentes orgánulos celulares. Operaciones B sicas en el Laboratorio de Qu mica. Centrifugaci n. Tipos de Centrifugaci n. (s/f). PLANTEAMIENTO DE EL PROBLEMA: ¿Por qué son útiles estudiar los núcleos de las células y separarlos por centrifugación? El estudiar los Núcleos de las células es muy importante principalmente por qué al ser una parte muy importante de las células es necesario estudiarlos para comprenderlos e identificar sus partes que nos pueden ser útiles en momentos laborales para identificar ciertas anomalías en ellos y se utiliza la centrifugación precisamente por qué es la manera más adecuada de separar los núcleos para posterior mente usar la técnica de tinción y poderlos ver detalladamente. JUSTIFICACIÓN: En esta práctica llevamos a cabo el uso del método de separación de la lisis mecánica con ayuda de la centrifugación para el aislamiento de nucleos para así diferenciar por tinciones las características de los núcleos de las células.
OBJETIVOS :
General: Aislamiento de núcleos por medio de la lisis mecánica. Específicos:
- Comprender los fundamentos de la lisis mecánica para la obtención de núcleos celulares.
- Analizar y utilizar conocimientos básicos de la centrifugación para la separación de organelos.
- Diferenciar por tinciones las características de los núcleos de las celulas. HIPÓTESIS : La práctica de laboratorio de aislamiento de núcleos resultará en la obtención de núcleos celulares viables y puros que podrán ser utilizados para el análisis de su estructura, función y contenido genético.
MÉTODO:
Lavar , secar , cortar y limpiar las hojas de espinaca. Agregar 25 ml de amortiguador de fosfatos junto con las hojas para la lísis. Filtrar con ayuda de una gasa aprox. Recuperar 10 ml. Primera centrifugación - 600 g. 5min. Retirar el sobrenadante y se mantener la patsilla (núcelos) esta se re suspende en 5 ml de sacarosa al 5% disuelta en amortiguador de F. Colocar 3ml de la fracción anterior en el gradiente de sacarosa 80,30.10. Segunda centrifugación 500g. 15 min. Retirar las bandas de el gradiente de sacarosa y se colocan en tubos Eppendorf 1.5 ml. Agregar 1 ml de amortiguador de F y se mezcla. Tercera centrifugación - pastilla de 1000 grav ,5min. Retirar sobrenadante y se colocan 5 ml de amortiguador F a 1000 grav. Incubar las muestras en congeladores. Retirar de los congeladores 1 semana después. Dejar descongelando por unos 20 min aprox.
cuando comparamos nuestras vistas obtenidas podemos observar una similitud bastante notoria en cada procedimiento y resultado utilizando cada tipo de tincion (fig 1 – fig 4) que en los núcleos vegetales gracias a su permeabilidad selectiva se absorberán permitiéndonos así observar con sumo detalle los núcleos en este caso vegetales de las espinacas maceradas viéndose de distintas maneras usando cada tipo de tinción(fig 1- fig 4 ) CONCLUSIÓN : La práctica de laboratorio de aislamiento de núcleos resultó exitosa en la obtención de núcleos celulares viables y puros. Siguiendo el protocolo adecuado, fue posible separar los núcleos de otros componentes celulares, como las células intactas y los orgánulos subcelulares , la viabilidad de los núcleos se mantuvo durante el proceso de aislamiento, lo que sugiere que conservaron su capacidad para llevar a cabo funciones nucleares esenciales. REF: Operaciones B sicas en el Laboratorio de Qu mica. Centrifugaci n. Tipos de Centrifugaci n. (s/f). Www.ub.edu. Recuperado el 17 de junio de 2023, de https://www.ub.edu/oblq/oblq%20castella no/centrifugacio_tipus.html Katerine, A., Parra, C., & Romero Martínez, J. K. (s/f). COMPARACIÓN DE LAS COLORACIONES NILE-RED Y SUDÁN III PARA LÍPIDOS EN Caenorhabditis elegans ALEJANDRA GARNICA GUZMÁN. Edu.co. Recuperado el 17 de junio de 2023, de https://repositorio.fucsalud.ed u.co/bitstream/handle/001/ 47/Comparaci%C3%B3n%20d e%20las%20coloraciones% NILE- RED%20Y%20SUD%C3%81N %20III%20para%20l%C3%AD pidos%20en%20Caenorhabditi s%20elegans.pdf?sequence=1& isAllowed=y#:~:text=Sud%C
%A1n%20IV%20(C24H20N4O )%20es%20un,y%20lipoprote %C3%ADnas%20en%20seccio nes%20parafinadas. Páez, J. C. (2021, febrero 26). Célula vegetal: qué es, partes, características y funciones. ecologiaverde.com. https://www.ecologiaverde.com/celula- vegetal-que-es-partes-caracteristicas-y- funciones-3278.html Diccionario de cáncer del NCI. (2011, febrero 2). Instituto Nacional del Cáncer. https://www.cancer.gov/espanol/p ublicaciones/diccionarios/dicciona rio-cancer/def/proteina ¿Qué es una célula? (s/f). Medlineplus.gov. Recuperado el 17 de junio de 2023, de https://medlineplus.gov/spanish/genetica/ entender/basica/celula/ S/f-e). Researchgate.net. Recuperado el 17 de junio de 2023, de Revista Científica Colegio Camilo Henríquez Vol. 1 Año 1. (2012, enero 12). Issuu. https://issuu.com/portalcamili no/docs/revista-cientifica https://www.researchgate.net/figure/Aisla miento-de-los-nucleos- celulares_fig3_ (S/f-f). Recuperado el 17 de junio de 2023, de http://file:///Users/julia/Download s/jrodriguezmartinez,+1962.04.03. 0145.pdf
