M.C. Alma Teresa Miranda Quiroz
UNIVESIDAD TECNOLOGICA DE MORELIA
M.C. Alma Teresa Miranda Quiroz
Manual de Prácticas de
Laboratorio de
“Biología Molecular I”
“Química Área Biotecnología”
Cuarto Cuatrimestre
Prepara tus exámenes
Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Consigue puntos base para descargar
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Orientación Universidad
Prepara tus exámenes
Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Busca documentos
Prepara tus exámenes con los documentos que comparten otros estudiantes como tú en Docsity
Busca documentos en el Store
Los mejores documentos en venta realizados por estudiantes que han terminado sus estudios
Video Cursos
Estudia con lecciones y exámenes resueltos basados en los programas académicos de las mejores universidades
Quiz
Responde a preguntas de exámenes reales y pon a prueba tu preparación
Consigue puntos base para descargar
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Comunidad
Pregúntale a la comunidad
Pide ayuda a la comunidad y resuelve tus dudas de estudio
Ranking de las universidades
Descubre las mejores universidades de tu país según los usuarios de Docsity
Ebooks gratuitos
¡Nuestros e-books salva-estudiantes!
Descarga nuestras guías gratuitas sobre técnicas de estudio, métodos para controlar la ansiedad y consejos para la tesis preparadas por los tutores de Docsity
Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular I: Guía para Estudiantes de Biotecnología, Ejercicios de Biología Molecular
Manual de practicas de biologia molecular
Tipo: Ejercicios
2019/2020
1 / 29
Esta página no es visible en la vista previa
¡No te pierdas las partes importantes!
Documentos relacionados
Vista previa parcial del texto
¡Descarga Prácticas de Laboratorio de Biología Molecular I: Guía para Estudiantes de Biotecnología y más Ejercicios en PDF de Biología Molecular solo en Docsity!
UNIVESIDAD TECNOLOGICA DE MORELIA
M.C. Alma Teresa Miranda Quiroz
Manual de Prácticas de
Laboratorio de
“Biología Molecular I”
“Química Área Biotecnología”
Cuarto Cuatrimestre
“Química: área Biotecnología”
ÍNDICE
Práctica 6. Electroforesis en gel de agarosa…………………………………………………………………………….
- Asignatura: Biología molecular I Revisión: MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO
- Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 2 de
- COMPETENCIAS A LAS QUE CONTRIBUYE LA ASIGNATURA...................................................................... Página
- OBJETIVO DE LA ASIGNATURA.
- PROGRAMA DE LA ASIGNATURA
- Lineamientos en el laboratorio
- Evaluación del curso
- Reporte
- Introducción
- Normas de Bioseguridad
- Práctica 1 .Extracción de ADN
- Práctica 2.Electroforesis en gel de agarosa
- Práctica 3 Cuantificación y calidad de ADN
- Práctica 4. Inducción, detección y aislamiento de mutantes ……………………………………..............
- Práctica 5 Extracción de ARN total ….……………………………………………………………………………
- Práctica 8 Regulación genetica del operón lac Práctica 7. Cuantificación y calidad de ARN…………………………………………………………………………….
- FUENTES BIBLIOGRÁFICAS.
- Sugeridas.
- De apoyo.
- Compiladores.
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 4 de 29 2.2.1 Conceptos 2.2.2 Mutaciones 2.2.3 Bases químicas de las mutaciones, Tipos de mutaciones y su expresión
2.3 Mecanismos de reparación del ADN
2.3.1. Daño del ADN 2.3.2 Mecanismos de reparación del ADN
3 UNIDAD TEMÁTICA III – EXPRESIÓN GÉNICA
Resultado del aprendizaje.
El alumno a partir de un caso dado inhibirá e inducirá una proteína y realizará un reporte que incluya:
- El mecanismo de transcripción y traducción de la proteína.
- Secuencia de aminoácidos
3.1 Transcripción del ARN
3.1.1 Concepto de Transcripción. 3.1.2 Proceso de síntesis del ARN en procariotes 3.1.3 Proceso de síntesis del ARN en eucariotes 3.1.4 Procesamiento del ARN
3.2 Traducción
3.2.1 Código Genético. 3.2.2 Síntesis de proteínas 3 .2.3 Plegamiento de proteínas y chaperonas moleculares. 3.2.3 Procesamiento de proteínas
4 UNIDAD TEMÁTICA IV – MECANISMOS DE REGULACIÓN GENÉTICA EN
PROCARIONTES
Resultado del aprendizaje.
El alumno a partir de un caso dado inhibirá e inducirá una proteína y realizará un reporte que incluya:
- Tipo de organismo utilizado
- Proteína inducida e inhibida
- Procedimiento de inducción e inhibición de la proteína
- Procedimiento de atenuación
- Observaciones 4.1 Regulación de la síntesis de ARNm 4.1.1 Conceptos 4.2 Operón lactosa y el regulon NIF 4.2.1 Concepto y funcionamiento del operón 4.2.2 Control positivo y negativo del operón 4.2.3 Concepto del regulón 4.2.4 Organismos que poseen operones y regulones 4.3 Atenuación 4.3.1 Concepto de atenuación
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 5 de 29
PRACTICA No 1
EXTRACCIÓN DE ADN
OBJETIVO
Extraer ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos Conocer la metodología básica para la extracción de ADN Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la extracción de ADN
FUNDAMENTO
La biología molecular es una de las herramientas más útiles de las que se vale hoy en día la ciencia. Una de las herramientas más importantes es precisamente la extracción y purificación del ácido desoxirribonucleico (ADN), la cual se puede obtener de diferentes organismos, tales como virus, bacterias, humanos, plantas, entre otros. Para este propósito existe una gran cantidad de métodos de los que derivan las siguientes etapas:
- Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes celulares
- Precipitación de los ácidos nucleícos y disolución en un buffer adecuado Homogenización de la muestra El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Tejidos resistentes, necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material de interés. Se han descrito diversos métodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilización de los componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas. Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros pasos siguientes de la purificación de ácidos nucleícos, las moléculas de gran tamaño (como por ejemplo las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo tamaño es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos utilizados para la homogeneización y purificación. Los métodos más vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al maximizar el número de células lisadas, pero por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del ADN. Extracción de proteínas y lípidos Los ácidos nucleícos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgánico no polar, los ácidos nucleícos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase orgánica. En la preparación de ácidos nucleícos, los solventes que se usan más frecuentemente para la extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo.
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 7 de 29
- Agregar 250 μL de agua desionizada estéril al paquete celular.
- Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células (aproximadamente 30 s).
- Agregar 250 μL de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).
- Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
- Agregar 250 μL de cloroformo.
- Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.
- Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
- Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 μL) y colocarla en otro tubo de 1.5 mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la muestra e inhibir reacciones posteriores.
- Agregar 225 μL de cloroformo.
- Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
- Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
- Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 μL) y colocarla en otro tubo de 1.5 mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.
- Agregar 20 μL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
- Agitar en vortex 20 s.
- Agregar 440 μL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
- Centrifugar a 19000 g durante 30 min.
- Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento.
- Agregar 500 μL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado, evitando resuspender la pastilla.
- Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
- Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento. 2 5. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo, hasta que todo el etanol haya sido evaporado.
- Resuspender el ADN en 50 μL de TE pH 7.8 o agua desionizada. Guardar a - 20°C. Extracción de ADN bacteriano de muestras de Suelo
- Pesar 0.1 mg de suelo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
- Agregar 250 μL de agua desionizada estéril.
- Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células (aproximadamente 30 s).
- Agregar 250 μL de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).
- Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
- Agregar 250 μL de cloroformo.
- Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.
- Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
- Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 μL) y colocarla en otro tubo de 1.5 mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la muestra e inhibir reacciones posteriores.
- Agregar 225 μL de cloroformo.
- Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
- Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
- Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 μL) y colocarla en otro tubo de 1.5 mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.
- Agregar 20 μL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
- Agitar en vortex 20 s.
- Agregar 440 μL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
- Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado.
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 8 de 29
- Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento.
- Agregar 500 μL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado.
- Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
- Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento.
- Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo, hasta que todo el etanol haya sido evaporado.
- Resuspender el ADN en 50 μL de TE pH 7.8 o agua desionizada. Guardar - 20°C Extracción de ADN de plantas
- En un mortero moler alrededor de 1 g de tejido con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino.
- Agregar 1 ml de buffer CTAB 2X y seguir moliendo. Recuperar en un microtubo de 1.5 ml.
- Centrifugar a 8 000 xg durante 8 min. a 4°C.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender con 600 μl de CTAB 2X.
- Incubar a 60ºC durante 10 min.
- Agregar 600 μl de cloroformo:octanol 24:1, agitar hasta homogeneizar.
- Centrifugar a 5 000 xg durante 12 min. a 4°C (o hasta que le sobrenadante quede transparente).
- Trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo, cuidando de no tomar la interfase.
- Agregar 2/3 del volumen final de isopropanol frío para precipitar el ADN.
- Dejar reposar durante la noche a - 20°C.
- Centrifugar a 8000 xg durante 5 min a 4°C. Eliminar perfectamente el sobrenadante.
- Limpiar el ADN agregando 1 ml de etanol 70% frío y centrifugar a 7 000 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender con 100 μl de buffer TE. RESULTADOS CONCLUSIONES CUESTIONARIO 1.- Explica la importancia que tiene el purificar ADN. 2.- Describir la función de cada reactivo utilizado durante la práctica. REFERENCIAS Sambrook, J. y Russell, D. W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA. 2344 págs.
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 10 de 29 corriente eléctrica aplicada, la fuerza iónica del buffer y de la cantidad del colorante presente (fundamentalmente en el caso de la forma I). (d) Corriente aplicada A bajo voltaje, la velocidad de migración de los fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo eléctrico aumenta, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lo tanto el intervalo efectivo de separación en los geles de agarosa disminuye a medida que el voltaje es incrementado. (e) Otros factores Otros factores que influyen son: la dirección del campo eléctrico, la composición de bases de los fragmentos a analizar, la temperatura y la composición del buffer de electroforesis. DESARROLLO EXPERIMENTAL Material Puntas estériles Pipetas automáticas Camas y peines de electroforesis Vaso de precipitado (para desecho). Erlenmeyer de 100 ml Cinta adhesiva Tubos eppendorf para microcentrifuga de 1. Puntas para micropipetas estériles Guantes . Reactivos y soluciones Agarosa Agua destilada Solución TAE 1X (Buffer de electroforesis) Bromuro de etidio (10 mg/ml) Marcador de peso molecular (1000 pb) Tris-Base Acido acético glacial EDTA 0.5 M (pH 8.0) Colorante de carga 6X Naranja G o azul de bromofenol Equipo Fuente de alimentación. Microcentrífuga Microondas Balanza Transiluminador Cámara de electroforesis horizontal Material biológico ADN genómico de E. coli , planta y población microbiana del suelo Secuencia experimental
1. Preparación del gel de agarosa al 1 % y preparación de la muestra
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 11 de 29 a. Preparar el recipiente para el gel limpiando con etanol una cama de electroforesis y sellándola por los lados con cinta adhesiva. b. En un matraz mezclar una cantidad adecuada de agarosa (1 g) con tampón TAE 1X (100 ml). Calentar la mezcla (agarosa + TAE) con la ayuda de un microondas u hornillo eléctrico hasta fundir y disolver completamente la agarosa (¡cuidado al agitar el matraz, que la agarosa al calentarse puede salpicar abruptamente fuera del matraz y producir serias quemaduras!). c. Una vez fundida la agarosa se va a añadir bromuro de etidio (≈ 0,25 μg/ml final) que es un poderoso MUTAGENO!, USAR GUANTES. d. Verter la mezcla en la cama y colocar el peine cerca de uno de los bordes de la misma. Dejar que la agarosa solidifique sin mover la cama. El bromuro de etidio se intercalará entre las bases del DNA y emitirá fluorescencia en el rango visible del espectro electromagnético, tras ser irradiado con luz ultravioleta, permitiendo visualizar los fragmentos de DNA. e. Una vez solidificado el gel, retirar el peine y observar los pocillos formados. Retirar las cintas adhesivas. Colocarlo en la cámara de electroforesis y Llenarla con buffer TAE 1X hasta que se cubra el gel, aproximadamente 1.0 mm por encima de él.
2. Preparación de la muestra a. En un tubo eppendorf limpio añadir 20 μl (10 μl del ADN aislado anteriormente + 10 μl de agua) de la disolución de ADN y 3 μl de “tampón de carga” (Esta disolución contiene glicerol, un agente densificante que sirve para que las muestras sedimenten en el fondo de los pocillos y azul de bromofenol, un colorante de pequeño tamaño molecular que sirve para controlar la migración del frente de la electroforesis). b. Centrifugar ligeramente la mezcla SÓLO si hay demasiadas gotas repartidas dentro del tubo, con objeto de recoger todo el volumen de muestra. 3. Electroforesis a. Depositar la muestra en uno de los pocillos del gel de agarosa al 1% previamente fabricado mediante una micropipeta automática. Reservar un pocillo, para colocar el patrón (500 ng) que contiene los fragmentos de DNA de tamaño conocido. Cerrar o tapar la cámara de electroforesis, colocar los electrodos de la cámara de electroforesis a la fuente de alimentación de tal forma que el polo negativo (negro) quede al lado de los pocillos y el polo positivo (rojo) en el extremo opuesto del gel, hacia donde va a migrar el ADN, y aplicar una corriente eléctrica continua de 100-120 voltios b. Detener la electroforesis tras unos 60 minutos o cuando el colorante haya recorrido las tres cuartas partes del gel. Visualizar el ADN con ayuda de un transiluminador de luz ultravioleta de onda corta. 4. Determinación del tamaño de los fragmentos de DNA. Tomar una foto si es posible o bien dibujar y describir lo que se observo. Si el DNA genómico fue aislado correctamente debe aparecer como una banda de alto peso molecular y con un ligero barrido por debajo de ella. Si aparecen barridos más extensos o de bajo peso molecular quiere decir que el DNA se degrado en algún paso del aislamiento, este DNA degradado es un DNA de mala calidad el cual no podrá ser utilizado en experimentos subsecuentes en el laboratorio. Sobre la fotografía del gel de electroforesis, medir la distancia recorrida por las bandas, desde el centro del pocillo hasta la banda, tanto de la muestra como de los patrones. Representar gráficamente las distancias migradas por las bandas patrón frente al tamaño (en pares de bases). Trazada la recta patrón, interpolar las distancias migradas por los DNAs problema para estimar su tamaño.
RESULTADOS
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 13 de 29
PRACTICA No 3
CUANTIFIACION Y CALIDAD DEL ADN
OBJETIVO
El alumno determinará la cantidad de ADN por métodos espectrofotométricos y en gel de
agarosa
El alumno determinará la calidad del ADN obtenido.
INTRODUCCION
Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad y la
cantidad del mismo.
Existen diversos métodos para determinar la concentración de DNA de una muestra. Entre
ellos se encuentran:
Sistemas semicuantitativos: a) por estimación de la intensidad de una banda en gel de
agarosa en el que el ADN es teñido por algún colorante como Bromuro de Etidio, Syber
Green o Gel Red; b) comparación de “gotas” conteniendo diferentes cantidades de muestra
con un patrón de DNA conocido, en presencia de EtBr;
Sistemas cuantitativos: métodos fluorimétricos y espectrofotométricos. Los primeros tienen
la ventaja de su sensibilidad y la desventaja de su puesta a punto. Además, requieren
sustancias tóxicas. Los métodos espectrofotométricos son los más populares porque son
fáciles de ejecutar y proporcionan resultados fiables.
La cuantificación del ADN se realizará mediante espectrofotometría utilizando el rango de luz
UV. Debido a los dobles enlaces conjugados en los anillos presentes en las bases
nitrogenadas del ADN, esta molécula tiene absorbancia máxima a 260 nm. Para determinar
la concentración se asume un rendimiento de 25 μg/0,5 ml de cultivo), al disolverlos en 50 μl
se obtendrá una concentración de 500 ng/μl). Dado que 1 unidad de densidad óptica a 260
nm (1OD 260 ) = 50 μg/ml en cubeta (= 50 ng/μl) para DNA de doble cadena (dsDNA), 40
μg/mL de ARN o 33 μg/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra, y que las medidas
fiables de densidad óptica oscilan entre 0,5 y 1,5 OD 260.
En las preparaciones de ácidos nucleícos, son frecuentes las impurezas de naturaleza
proteica. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, por lo que
la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de ácidos nucleícos.
Dado que el máximo de absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es
posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A
(ADN/proteínas). La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A
nm/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleícos puros. Para el ADN doble hebra
en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8, y para ARN, A260/A280 ≥ 2.0.
Valores menores de 1,8 son típicamente causados por contaminación proteica. Valores
mayores de 2,0 generalmente se deben a contaminación con RNA. Para que la
cuantificación de ácidos nucleícos sea adecuada se requiere la habilidad de medir de
manera exacta y reproducible.
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 14 de 29
MATERIAL
Puntas estériles de diferentes capacidades (10 y 200 μL)
Tubos eppendorf de 1.5 ml
Vaso de precipitado (para desecho)
Celdas de cuarzo
Pizeta
Reactivos y soluciones
Agua destilada
Equipo
Microcentrífuga
Espectrofotómetro
Pipetas automáticas
Muestra biológica
Muestra de ADN concentración desconocida
METODOLOGIA
Cuantificación de ADN en gel de agarosa
a) Para esta prueba se utilizará el gel agarosa resultado de la electroforesis de la
práctica anterior.
b) Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar según instrucciones.
c) La determinación semicuantitativa de la cantidad de ADN en cada una de las
muestras utilizadas, se realizará mediante la comparación de la intensidad de
fluorescencia de la muestra con la del marcador de peso molecular, tomando en
cuenta que en el gel se cargo a una concentración de 500 ng. Si su fluorescencia es
similar la concentración de la muestra puede determinarse aproximadamente de 500
ng.
Cuantificación de ADN por métodos espectrofotométricos
a) Realice diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras proporcionadas por triplicado con
agua destilada en tubos de polipropileno estériles.
c) Encienda el espectrofotómetro al menos 15 minutos antes de iniciar las lecturas.
d) Mantenga las muestras en hielo o en refrigeración hasta ser cuantificadas
b) Utilizando agua destilada como solución blanco, determine la absorbencia de cada
muestra a 260 nm.
c) Determinar la concentración de ADN
μn/ml de ADN = (Abs260 X Factor Dilución X 50 μg ADN/ml)
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 16 de 29
PRACTICA No 4
INDUCCION, DETECCION Y AISLAMIENTO DE MUTANTES
OBJETIVOS
Aislar mutantes auxotrofas de E. coli utilizando la luz ultravioleta como agente mutagenico. Aislamiento de mutantes espontáneas de E.coli resistentes a la Rifampicina. Medir la frecuencia de mutaciones espontáneas.
FUNDAMENTO
Las mutaciones son cambios en la secuencia de bases el cual no es derivado de un proceso de recombinación y es heredable. El organismo que posee características diferentes a las silvestres es llamado mutante y el agente causante de dicha mutación se conoce como mutágeno, estos pueden ser agentes químicos, físicos o biológicos. Las mutaciones pueden ocurrir espontáneamente o después de la inducción con agentes mutagénicos. Las mutaciones espontáneas pueden ser debido a la acción de las radiaciones naturales e incluso durante la replicación del DNA debido a errores en la lectura de las bases. Estos errores ocurren con una frecuencia de 10 -^7 a 10-^10 por pares de bases durante una replicación. La frecuencia de mutación (la proporción de mutantes en la población) puede aumentarse significativamente con el uso de mutágenos. De esta manera puede incrementarse hasta 10-^4 a 10-^7 en el aislamiento de mejores productores de metabolitos secundarios e incluso hasta 10-^2 - 10 -^1 en el aislamiento de mutantes auxótrofos. Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados sustratos, pero pueden recurrir a otros alternativos. Para aislar estos mutantes se puede recurrir en muchos casos al uso de medios diferenciales que incorporan indicadores de pH, que cambian de color en función del uso o no del sustrato en cuestión. Después de un proceso de mutación algunos organismos (conocidos como revertantes) puede regresar a su estado silvestre tanto fenotípica como genotípicamente o solo una de los dos, a este proceso se le conoce como reversión. Tanto los mutantes espontáneos como los inducidos se producen como resultado de los siguientes cambios estructurales en el genoma: · La mutación en el genoma puede causar cambios en el número de cromosomas. · La mutación en el cromosoma puede cambiar el orden de los genes dentro del cromosoma. · La mutación puntual puede resultar de cambios en la secuencia de bases dentro de un gen. Dentro de los agentes mutagénicos existen una gran variedad de agentes físicos, químicos y biológicos que pueden inducir mutaciones.
- Agentes químicos: los agentes químicos se clasifican según su modo de acción en: a) Análogos de bases, tales como el 5-Bromouracilo o la 2-Aminopurina se incorporan en el DNA que se replica en lugar de las bases correspondientes timina y adenina. b) Agentes que reaccionan con el DNA que no se está replicando ocasionando cambios químicos en las bases lo que provoca un apareamiento incorrecto. Tales como el acido nitroso (HNO2), hidroxilamina (NH2OH), agentes alquilantes incluyendo el etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), N-metil-N-nitro- N-nitrosoguanidina (NTG), N-metil-N-nitroso urea y gas mostaza. Estos originan la formación de bases alquiladas en el DNA lo que origina transiciones y deleciones. c) Agentes intercalantes, son sustancias como acridinas y bromuro de etidio, son moléculas planas que se insertan entre dos pares de bases del DNA, separándolas entre sí. Durante la replicación, esta conformación
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 17 de 29 anormal puede conducir a inserciones o deleciones en el DNA, originando mutaciones por corrimiento del marco de lectura.
- Agentes físicos: como parte de los agentes físicos se encuentran las radiaciones tales como: Uno de los más efectivos es la radiación ultravioleta de longitud de onda corta (200 y 300 nm con un óptimo a 254 nm que es la absorción máxima del DNA). En la célula, la absorción directa de la radiación UV se halla principalmente confinada a los compuestos con estructuras orgánicas anulares como las purinas y las pirimidinas. Los productos más importantes de la acción de la luz UV son dímeros (timina-timina; timina- citosina; citosina-citosina) que se forman entre pirimidinas (T, C) adyacentes, lo que incrementa enormemente la probabilidad de que durante la replicación del DNA, la DNA polimerasa inserte un nucleótido incorrecto en tal posición. Dichos dímeros distorsionarían la hélice de DNA e interferirían con la replicación de la misma. El tipo más frecuente de fuente de radiación UV que se usa para mutagénesis es la lámpara microbicida que emite grandes dosis de radiación UV en la región de 260 nm. Se suele utilizar una dosis de radiación UV que produzca un 90% - 95% de muerte en la población buscándose posteriormente, entre los sobrevivientes, los mutantes. Cuando las poblaciones irradiadas con luz UV son expuestas subsecuentemente a la luz visible, la velocidad de supervivencia aumenta y la frecuencia de mutación desciende. Esto se debe a la activación de una enzima de fotorreactivación que corta los dímeros de timina. En presencia de luz, la enzima corta los dímeros originando pirimidinas monoméricas. Hasta el 80% de los dímeros de timina que existen en el genoma pueden ser fotorreactivados. La radiación ionizante es una forma de radiación más potente e incluye rayos de longitud de onda corta como los rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma. Esta radiación causa la ionización del agua y de otras sustancias; produciéndose indirectamente efectos mutagénicos debido a esta ionización. Entre las potentes especies químicas formadas por la radiación ionizante se encuentran radicales libres, siendo el más importante el radical hidroxilo (OH-). Los radicales libres reaccionan en la célula con macromoléculas, como el DNA, y las inactivan produciendo rupturas que dan lugar a cambios estructurales importantes como son las mutaciones cromosomales.
- Biológicos: en este caso los bacteriófagos participan en el fenómeno de recombinación genética de Transducción
- Métodos adicionales de mutagénesis A. Mutagénesis por elementos transponibles. Si se produce la inserción de un elemento transponible dentro de un gen se pierde, en general, la función del gen ya que se altera la secuencia codificadora del gen en el que modifica las propiedades del organismo que los porta (marcadores de resistencia a fármacos y otros genes fácilmente seleccionables). B. Mutagénesis dirigida Como se menciono anteriormente las mutaciones génicas se dice que son espontáneas cuando ocurren sin intervención de procedimientos mutagénicos experimentales. Las mutaciones bacterianas espontáneas son aleatorias, y afectan a un gen cualquiera con frecuencias dentro del rango de 10-^5 a 10 -^10 por célula y división. En los años 50 se observó el siguiente fenómeno: cuando un cultivo bacteriano de una cepa sensible a un antibiótico se pone en contact o con ese ant ibiót ico, al cabo del tiempo se comprueba que todo el cultivo const a de bact erias resist en tes, ant e est o a través de experimentos, quedó demostrado que lo único que hace el ant ibiót ico es seleccionar los mutantes resistentes espontáneos que surgen en la población independientemente de la presencia del agente selectivo. Esta es precisamente la base genética del surgimiento de ciertas cepas patógenas resistentes a antibióticos: el fármaco inhibe o mata las bacterias silvestres sensibles, pero no afecta a los pocos individuos que por mutación espontánea hayan adquirido un alelo resistente; estos individuos se mult iplican, de modo que al f inal son los más prevalentes. La resistencia bacteriana al ant ibiót ico rifampicina puede result ar de una mutación común. La rifampicina inhibe la transcripción bacteriana interfiriendo con la actividad normal de la ARN-polimerasa. Las bacterias pueden adquirir resist encia por una mut ación punt ual de la subunidad β de la ARN - polimerasa, que está codificada por el gen rpo B. E s t a m u t a c i ó n a l t e r a d e f o r m a suficiente la estructura de la subunidad β de modo que pierde especificidad para la molécula de la rifampicina. Como resultado, la ARN-polimerasa deja de tener afinidad por la rif ampicina, y ya no queda afectada por el ef ect o inhibidor del ant ibiótico. La resistencia a rifampicina también ha sido atribuida a
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 19 de 29
RESULTADOS
CONCLUSIONES
CUESTIONARIO
REFERENCIAS
Agapito, J. 2003. Caracterización de las Mutaciones en el Gen rpo B asociadas a la Resistencia a Rifampicina y Tipificación Molecular Mediante Rflp (Is6110) En Cepas de M. Tuberculosis de Pacientes con Tuberculosis Pulmonar.Enfermedades del Tórax 2003; 46 (1): 9- 24 Anderson, L. La resistencia de las bacterias a los antibióticos.
“Química: área Biotecnología” MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO Asignatura: Biología molecular I Revisión: 0 Cuatrimestre : Cuarto Plan de estudios: 20 15 Página 20 de 29
PRACTICA No 5
EXTRACCION DE ARN TOTAL
OBJETIVO
Extraer ARN de un organismo procariota ( E. coli ). Conocer la metodología básica para extracción de ARN, Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de Agarosa
FUNDAMENTO
El RNA es el ácido nucleíco más abundante en la célula, y puede purificarse fácilmente. Una célula típica contiene 10 veces más RNA que DNA. El azúcar presente en el RNA es la ribosa, que posee un grupo hidroxilo (OH) libre en la posición 2'. Este grupo participa en la formación de un intermediario en el mecanismo de hidrólisis y determina que el RNA sea químicamente inestable, y se hidrolice fácilmente en una solución acuosa alcalina. En la mayor parte de los casos, el RNA es un polímero monocatenario (ssRNA), pero las secuencias nucleotídicas de estas moléculas poseen, en mayor o menor medida, regiones complementarias que determinan tramos de apareamientos intracatenarios (estructura secundaria en forma de dsRNA). Las RNAsas utilizan el mismo mecanismo que se observa en la catálisis alcalina, pero la mayoría de estas enzimas atacan exclusiva o preferentemente la ssRNA. Cuando se desea clonar un determinado gen para luego analizar su expresión resulta de mucha importancia la obtención de preparaciones de RNA limpias y que contengan moléculas intactas. El RNA proveniente de cualquier célula puede ser copiado a moléculas de DNA de doble hebra y estas luego pueden ser clonadas en un vector resultando en la producción de bibliotecas de cDNA específicas del tipo celular en cuestión. Para que estos clones sean útiles en el análisis resulta crítico que se cuente con RNAs íntegros y completos como material de partida. La mayor dificultad para la obtención de dichas preparaciones es que la mayoría de las RNAsas, que degradan nuestras moléculas de interés, son enzimas muy estables y activas no requiriendo cofactores para su funcionamiento. Una pequeña cantidad de las mismas que permanezca como contaminante en nuestra preparación puede constituir un verdadero problema. Existen tres pasos fundamentales en la extracción de un ácido nucleico (DNA o RNA): 1) Homogeneización de la muestra: Permite la disgregación de la estructura tisular y celular para facilitar la salida de los ácidos nucleicos. Dentro de los métodos para la homogenización podemos mencionar los físicos como la sonicación, hervido, congelación-descongelación, choque osmótico, etc; los químicos como la utilización de detergentes (SDS) y también los enzimáticos como la lisozima, la proteinasa K, etc. El agregado de quelantes de magnesio, como el EDTA, a las soluciones de extracción contribuye también a la reducción de la integridad de las membranas. 2) Separación y Purificación: Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros contaminantes celulares y la obtención de un material genético cada vez mas limpio. Dentro de las metodologías utilizadas las más comunes son la extracción con mezclas de fenol-cloroformo y la separación cromatográfica. En el caso del fenol-cloroformo, el primero se utiliza para la desnaturalización y solubilización de las proteínas y componentes celulares y el cloroformo permite la separación de las fases durante la centrifugación, además de también ser desnaturalizante. Cuando lo que se utiliza es una separación cromatográfica generalmente se recurre a columnas preempaquetadas ya sea de afinidad o de intercambio iónico previa unión del ácido nucleico a resinas o matrices de sílice. Estas son lavadas varias veces para eliminar contaminantes y posteriormente se procede a la elución del ácido nucleico. 3) Precipitación: Permite la obtención del ácido nucleico listo para ser almacenado o diluido a la concentración deseada para su utilización. Este paso se realiza mediante el agregado de 1 volumen de isopropanol o 2 a 3 volúmenes de etanol.