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Este documento ofrece una introducción a la genética, el papel fundamental del ADN en la salud y la enfermedad, y el descubrimiento de los transposones y su papel en la transferencia de ADN. Además, se explica el proceso de transferencia del ADN mediante el factor F y la formación de células hfr y f'. Se incluye información sobre la importancia de este descubrimiento para la biotecnología moderna.
Qué aprenderás
Tipo: Apuntes
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República Bolivariana de Venezuela Ministerio del Poder Popular para la Educación Universitaria Universidad Politécnica “Territorial José Félix Ribas” Programa Nacional de Formación Medicina Veterinaria Socopó-EDO-Barinas
-Docente: Wiliam Vega -Bachilleres: Alex Porras v-28.421. Jhonnayra Rendon v-28.421. Keyla Salas v-280645. Mayerlys Mendez v-28.550. Luisana Araque v-28.591. Socopo, Marzo del 2022.
espectro de enfermedades clínicas. estas posibilidades se han visto incrementadas a partir del desarrollo de la ingeniería genética y la disponibilidad de técnicas de bilogía molecular. en la década de 1950 se descubrió que los genes no eran nada más y nada menos que cadenas de nucleótidos. un descubrimiento que parece tan sencillo desencadenó, sin embargo, el nacimiento de una nueva era: la de la tecnología del adn recombinante. la primera molécula de adn recombinante fue creada por paul berg , a comienzos de los 70. para aquella época, los biólogos moleculares habían aprendido a alterar genes individuales, cortar y pegar pedazos de adn de diferentes organismos y moverlos de uno a otro. otros pioneros de esta tecnología fueron stanley cohen, un genetista estadounidense, y herbert boyer, un bioquímico de la misma nacionalidad. cohen estaba interesado en aprender cómo los genes de plásmidos otorgan resistencia a las bacterias y boyer trabajaba con enzimas de restricción por lo que decidieron trabajar juntos. la recombinación consiste en la producción de nuevas combinaciones genéticas a partir de las generadas inicialmente por la mutación. dos moléculas de adn que posean distintas mutaciones pueden intercambiar segmentos y dar lugar a la aparición de nuevas combinaciones genéticas. en el caso de las bacterias existen diferentes mecanismos de recombinación a existencia de estos mecanismos permite la construcción de mapas genéticos en bacterias.
Biotecnologia La biotecnología se ha utilizado de forma rudimentaria desde que los primeros capacitados cerveceros comenzaron a utilizar cultivos de levaduras para elaborar cerveza. el gran avance que sentó las bases de la biotecnología moderna fue el descubrimiento de la estructura del adn a principios de la década de 1950. para comprender la forma en que este descubrimiento dio lugar al cabo del tiempo a los tratamientos biotecnológicos, resulta útil contar con un conocimiento básico del papel fundamental del adn en la salud y la enfermedad. la biotecnología no es una ciencia nueva, sino que su desarrollo inició desde hace miles de años, conocida como biotecnología tradicional la cual abarca la producción de alimentos tan antiguos como el vino, el queso, el yogurt, y la cerveza, entre otros. todos ellos son producidos a través de procesos metabólicos que realizan los microorganismos como lo es la fermentación. sin embargo, en la actualidad se ha desarrollado la biotecnología moderna, la cual surge hacia la década de los años 80, siendo su herramienta estratégica la ingeniería genética (manipulación y transferencia de genes) , la cual es aplicada al campo médico y la investigación biomédica. incluye la obtención de vacunas y de antibióticos, y el desarrollo de nuevos fármacos o moléculas terapéuticas, como por ejemplo la insulin. En fin esta ciencia agrupa todo el conjunto de técnicas, procesos y métodos que utilizan organismos vivos, como las bacterias, hongos y virus, partes de ellos o
un “amplio rango de huéspedes”, traspasando incluso los límites de género y especie. las primeras cepas resistentes (documentadas) fueron shigella flexneri aisladas en japón a fines de los ´50s. en estos aislamientos se hallaron plásmidos, llamados entonces factores r, que podían transferir esa resistencia a otras bacterias sensibles. desde muy temprano se los han dividido en plásmidos f (fertilidad) y r (resistencia). los plásmidos f portan una región con genes (tra) capacitándolos para gobernar su propia transferencia mediante el proceso de conjugación. más adelante se encontró que muchos plásmidos r codifican genes de transferencia y/o replicación tipo f (pudiendo haber ocurrido por recombinación entre ellos). el comportamiento “promiscuo” que presentan los plásmidos conjugativos r es el factor principal en la diseminación de genes de resistencia a antibióticos y de otros inhibidores del crecimiento los plásmidos son moléculas circulares de dna de doble cadena con un número variable de pares de bases de 1500 a 400.000. en los plásmidos se suele encontrar genes que regulan funciones especializadas sobre todo las de relación con el medio que rodea el microorganismo. codifican diferentes factores de virulencia como toxinas bacterianas, adhesinas y resistencia a metales pesados, entre otros. muchos plásmidos codifiquen, resistencia antibióticos, pero generalmente esta información se encuentra en elementos transponibles o transposones. los plásmidos se replican en forma autónoma (por razón por la cual se denomina replicones) independientemente del cromosoma y sin integrarse a este. el número de copias de plásmidos producido por una bacteria es específico de cada uno de ellas este número es copia puede ser alto (hasta de 50 copias) en plásmidos pequeños, o bajo una copia en el caso de plásmidos grandes. algunos plásmidos grandes como por ejemplo el factor f de fertilidad son episomas lo que indica que puede integrarse en el cromosoma de la bacteria es un ejemplo de plasmido conjugativo dado que poseen los genes trans relacionados relacionados con las transferencias es así como el factor f puede medir su propia transferencia de una célula a otra por conjugación.
Bacteriofagos : los bacteriófagos son virus bacterianos que pueden poseer dna simple o doble, o rna simple, rodeados por una capa proteica. el genoma de los bacteriofagos es un replicón único, pues contiene la información genética necesaria para su propia replicación. los bacteriofagos infectan células y se replican hasta un número elevado que ocasiona la lisis en la bacteria de la bacteria( infección lítica) o se integra en el genoma del hospedador sin producir la muerte bacteriana ( bacteria lisogenica). algunos fagos lisogenicos son portadores de genes que codifican para la producción de toxinas, por ejemplo: el corinefago b es portador de la toxina diftérica, la toxina eritogenica, producida por streptococcus pyogenes, y la toxina botulínica ,producidas por cepas lisogenicas de clastridium botulinum ,son codificas por profago. Transposones : estos elementos móviles son los llamados transposones, y los hay de diferentes tipos. su existencia fue anticipada por la genetista norteamericana barbara mcclintock, investigando los cromosomas del maíz en los años 40 del siglo pasado. se percató que la diversidad de pigmentación que tenían las semillas, los granos de maíz, en algunas mazorcas no podía explicarse mediante los elementos genéticos clásicos y propuso la existencia de unos nuevos elementos que tenían la capacidad de trasladarse entre diferentes zonas del genoma, en diferentes localizaciones de los cromosomas. estos resultados los publicó en 1950 en la revista pnas, pero la comunidad científica los ignoró y no le hicieron apenas caso durante bastantes años. ella misma dejó de trabajar en ese tema. en los años 60, 70, 80 y siguientes sin embargo se constató, por parte de diversos investigadores, la existencia de transposones en el adn de virus, bacterias, levaduras, protozoos, plantas y animales, confirmándose la explicación de mcclintock, quien finalmente vio reconocidas sus observaciones pioneras con el premio nobel de fisiología y medicina
la capacidad de las células para actuar como donantes se debe a la presencia del factor f o factor de fertilidad (célula macho). las células que carecen del factor f (f-o células hembras) son receptoras. el estudio genético ha experimentado un gran avance debido a la investigación de los factores de fertilidad o factor f de e. coli. el factor f es una molécula de adn de doble cadena, que posee todos los genes involucrados para: A) su propia transferencia B) la síntesis del pili sexual C) c) el inicio de la síntesis de adn en el “origen de la duplicación de transferencia”. el factor f puede presentarse como un plásmido de replicación autónoma, como parte integral del cromosoma, o como un plásmido con fragmentos pequeños del adn cromosómico. en síntesis, el factor f se transfiere a si mismo, convirtiendo a la célula receptora en f+; se integra en diferentes lugares del cromosoma bacteriano y genera una célula hfr (alta frecuencia de recombinación), y transporta el fragmento del adn cromosómico, convirtiendo a la célula receptora en f´ macho. en la transferencia del material genético, la función del pili sexual f sería la de unir células masculinas ( f+y f ´) y femeninas (f-) formando parejas. al reproducirse el apareamiento, el pili se retrae rápidamente y promueve la formación de contactos pared a pared, a través de los cuales se realiza la transferencia del adn. cuando se desencadena el mecanismo de transferencia, comienza la replicación del factor f. la movilización comienza con la formación de una muesca por la acción de una proteína (endonucleasa) en una de las cadenas del adn del factor f, en el orít. la cadena de adn 5´ terminal desplazada se dirige hacia la célula receptora. la transferencia del adn se realiza como una molécula con una sola cadena. en la célula receptora se sintetiza la cadena
complementaria de la cadena única de adn, y al completarse la transferencia y la duplicación del factor f, se produce la circularización. en la célula donadora, se produce la replicación circular continuada del adn y se recupera su forma (circulo rodante). esto explica porque la célula masculina sigue siendo f+ después de la transferencia. una característica importante del plásmido f o factor f es su capacidad para integrarse en diferentes lugares del cromosoma bacteriano. la integración del plásmido f en el cromosoma, por un proceso de recombinación, implica la ruptura y la nueva unión del adn. una vez integrado, forma una unidad de réplica en la célula vegetativa generando en una división celular normal, una célula hfr. estas células expresan los genes implicados en la movilización y la transferencia. la transferencia mediada por el factor f del cromosoma hfr se inicia por un corte en el orit. recordando la capacidad del factor f para integrarse en el cromosoma la transferencia de la secuencia f inicial es seguida por secuencias cromosómicas contiguas. durante la transferencia, el cromosoma de la célula donante suele romperse espontáneamente y al azar. por lo tanto la frecuencia con que un gen es heredado por los recombinantes disminuye exponencialmente cuando aumenta su distancia (la del gen) con respecto al origen de transferencia. los recombinantes que se producen por el apareamiento entre hfr y f- suelen permanecer f- (pues solo se transfiere una parte del factor f). cuando se transfiere todo el cromosoma hfr, con la secuencia f distal que presenta los genes relacionados con la transferencia se convierte en f+. la interrupción experimental del acoplamiento entre una célula hfr y una célula f- ha resultado útil para elaborar un mapa del adn cromosómico de e.coli. la velocidad de transferencia de genes de las células hfr es constante. esta característica permite medir la distancia entre los diferentes loci, por el tiempo que requiera la célula para transmitirlos por conjugación. se toma como “tiempo cero” el momento en que se
el adn transformante puede ser de origen bacteriano, viral o plásmidico. este adn penetra en la célula competente a través de receptores proteicos presentes en la superficie celular. la longitud de los fragmentos que puede penetrar varía entre 7 y 20 kb. en las bacterias grampositivas, la recombinación se realiza con una sola de las cadenas del adn que es transformante homóloga. la otra cadena en la superficie celular es digerida por endonucleasas. la cadena que penetra en el citoplasma se alinea con la secuencia complementaria de bases de una de las cadenas del adn de la célula receptora, sustituyendo a la región homóloga del cromosoma. una vez integrado se forma un heterodúplex (las dos cadenas son distintas). luego de la replicación de este adn hibrido, uno de los cromosomas adquiere la configuración original y el otro, los genes transformados. este último luego de la división celular da lugar a una célula transformada. en bacterias gramnegativas, penetran ambas cadenas de las cuales una sola se integra al cromosoma bacteriano, formando también un heterodúplex. el tamaño del adn transformante integrado varía entre 2 y 5 kb. el adn transformante antes de recombinarse puede ser digerido por enzimas de restricción. cuando el adn transformante es de origen plásmidico, debe presentar la forma circular covalentemente cerrada. una vez en el interior de la célula, el adn plásmidico puede replicarse en forma autónoma, integrarse en el cromosoma de la bacteria o recombinarse con el adn de otro plásmido. cuando el adn transformante es de origen viral, el proceso se denomina transfección. cuando el adn viral penetra en la célula receptora, puede quedar incorporado en el genoma bacteriano en estado de profago, producir el ciclo lítico o ser degradado por enzimas de restricción.
las células competentes poseen altas concentraciones de autolisinas que dejan al descubierto receptores de adn transformante. la transformación puede ser inhibida por la adnsa. esta sensibilidad del adn permite diferenciar la transformación de otros mecanismos de transferencia de genes. Transducción : es la recombinación genética mediada por fagos. cuando un fago infecta una bacteria, capta fragmentos del genoma de la célula hospedadora y los almacena en el interior de las partículas víricas. al lisar e infectar otra célula hospedadora, el fago transductor puede transferir no sólo sus propios genes sino también genes de la célula hospedadora de la cual procede. los fagos virulentos siempre inician un ciclo lítico, con producción de nuevas partículas virales que se liberan por lisis celular. los fagos atenuados pueden expresar o no el adn en la célula hospedadora. si lo expresan, existe una respuesta lítica. si no lo expresan, por un fago represor especifico, aquel queda en estado de profago, este o no integrado en el genoma bacteriano. la célula bacteriana es lisogénica y adquiere inmunidad contra fagos homólogos por la presencia del represor. el represor o proteína de inmunidad impide la transcripción de los genes responsables de la infección lítica. el mecanismo de transducción fue descubierto por zinder y lederberg (1952). estudiando la recombinación genética entre diferentes cepas de salmonella typhimurium, observaron que al separar dos poblaciones bacterianas diferentes, mediante filtros con un tamaño de poros que permitían el paso de agentes filtrantes, pero que impedían que el intercambio se produjera por el contacto directo de las bacterias (conjugación), se producía la recombinación. este proceso no era inhibido por la acción de adnsa. de los resultados de las observaciones realizadas en tubos en u, demostraron que algunas de las cepas de salmonella presente en una de las ramas del tubo, contenían un prófago este fago, luego de ser liberado por lisis espontanea de una célula salmonella, durante el crecimiento en un medio de cultivo determinado, a
en la transducción generalizada, al ocurrir la infección lítica del fago, el adn bacteriano se rompe en pequeños fragmentos quedando algunos de ellos incorporados dentro de las partículas víricas. luego de la lisis celular, estas partículas son liberadas en el medio, junto con partículas víricas normales, y se pueden iniciar la infección de otras células. en la transducción especializada, el fenoma del fago queda integrado en el adn del hospedador en un lugar específico. Mutación. Son cambios heredables de la secuencia de bases de adn pueden ser sustituciones, supresiones, inserciones y reordenamiento de bases; pueden ser espontanea o inducidas. Tipos de mutación: la clasificación molecular permite la comprensión de mecanismos de la mutación. las mutaciones por deleción o inserción pueden alterar la secuencia de bases en cualquier número de pares de bases e introducir alteraciones importantes en el genoma estas supresiones e inserciones, en general, son causadas por mecanismos de transposición. las mutaciones que cambian una base por otra se subdivide en transiciones y transversiones si se considera una de las células de la hélice, una mutación por transición cambia una purina por la otra (adenina - guanina) o una pirimidina por la otra (timina –citosina. por el contrario, una transversión interconvierte una purina por una pirimidina.
Consecuencias funcionales de la mutación. mutación por cambio de sentido: es cuando cambia un codón para un aminoácido, por otro. estas mutaciones son transiciones o transversiones en la secuencia del adn. la mayoría de las mutaciones son puntuales, pues se producen por el cambio en una sola base. las mutaciones silenciosas: son mutaciones puntuales, que no provocan un cambio en el fenotipo de las bacterias. no se produce cambio en los aminoácidos transportados para la síntesis proteica. estas mutaciones solo pueden detectarse secuenciado el gen. esto ocurre porque un aminoácido puede ser codificado por más de un codón. la mutación de sentido equivocado: es la que ocurre por la inserción en la proteína de un aminoácido diferente. si el nuevo aminoácido posee propiedades similares ( por ej, valina que sustituye a una alanina), puede tratarse de una mutación conservadora. esta mutación se expresa en la estructura de la proteína, y puede o no afectar su función; depende del tipo y del lugar en el que se encuentre el aminoácido sustituido. la mutación sin sentido es cuando un codón codifica para un aminoácido es sustituido por un codón de interrupción (por ej. tag o timidina-adenina-guanina), lo cual hace que el ribosoma pierda el marn, con la interrupción prematura de la síntesis proteica. se origina un péptido más corto, que en la mayoría de los casos no es viable. las mutaciones por supresión o deleción pueden alterar drásticamente la secuencia de aminoácidos de los productos génicos. la expresión exacta de las secuencias del adn depende de la transducción ordenada de los tripletes de nucleótidos en los codones. por lo tanto, una pequeña deleción o inserción que no ocurra en múltiplo de tres conduce a una mutación por cambio de estructura; se produce un
daño letal (mutaciones letales); si inmediatamente se incuban en la oscuridad, solo un infimo porcentaje de las bacterias forma colonias. si luego del tratamiento con uv, se irradian las células brevemente con luz azul del espectro visible, se restaura el daño (véase mecanismos de reparación del adn). el calor produce desaminación de los nucleótidos. agentes químicos: estos agentes mutagénicos pueden agruparse en tres clases:
el ácido nitroso y la hidroxilamina producen desaminación del adn. generalmente desaminan citosina a uracilo, lo que puede dar lugar a una transición cg a ta. Tecnologia del ADN recombinante El ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. por lo tanto, la tecnología de adn recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. de esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña. estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una superproducción, como en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. como las bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada. a esto justamente se dedica la biotecnología, es decir a la utilización de organismos vivos o de sus productos con fines prácticos. el desarrollo de la tecnología del adn recombinante fue posible gracias a varias líneas de investigación: 1) el conocimiento de las enzimas de restricción, 2) la replicación y reparación de adn, 3) la replicación de virus y plásmidos y 4) la síntesis química de secuencia Polimorfismo del adn: son las variaciones entre las secuencias de los nucleótidos del adn en individuos de una misma especie. para detectarlo se realiza el corte del adn con enzimas de restricción y los fragmentos obtenidos se analizan por