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BACILLUS
Es un género, no un grupo fisiológico como BAL.
Ambientes/ecosistemas naturales
Son de hábitats variados (alcalófilos, halófilos, psicrófilos, termófilos) por su plasticidad fisiológica. Agua dulce y mar. Suelo y arcilla. Rocas, polvo, vegetación. Alimentos y tracto gastrointestinal de insectos y animales. Ventaja en el ambiente por su capacidad de producir endosporas y biofilms. Estrategias de supervivencia del Género Bacillus: Biestabilidad : comportamiento en el que las cél aparentemente idénticas pueden cambiar la manera reversible a diferentes estados fisiológicos o tipos de células. Resultando en maximizar el rango de acción de la población celular para enfrentar y superar las condiciones ambientales adversas presentes y futuras. Esta diferenciación en múltiples tipos de células es el primer paso para desarrollar comunicades multicelulares como las biopelículas. Resistencia al calor, UV y otras radiaciones Resistencia a agentes qcos Resistencia a disecación No es estrategia exclusiva del Género Matriz extracelular compuesta de EPS, proteínas y AN Las células embebidas en el biofilm tienen protección frente a distintos agentes La matriz del biofilm ofrece protección adicional para las endosporas incrustadas, lo que permite la supervivencia y la colonización del entorno circundante cuando las condiciones son favorables
Formación de biofilm
Características generales
Morfología : Bacilos gram positivos, solos o agrupados en cadenas, formadores de endosporas resistentes a condiciones adversas. Nutrición : La mayoría son saprófitos, es decir, se alimentan de materia orgánica en descomposición. Metabolismo : Quimioorganótrofos. Algunos quimiolitótrofos facultativos. Mayormente heterótrofos nitrificantes, desnitrificantes, fijadores de nitrógeno, precipitadores de hierro. Capacidad de degradar sustratos diferentes derivados de fuentes vegetales y animales, que incluyen celulosa, almidón, proteínas, agar, hidrocarburos y también biocombustibles. Comportamiento frente al oxígeno: Aerobios obligados, por ende, catalasa . Algunos aerobios facultativamente anaerobios. Comportamiento frente a la acidez: Alcalófilos. Comportamiento frente a la temperatura: Psicrófilos y termófilos. Otras características: Mayoría móviles.
Metabolismo
Al ser saprófitos, se encuentran con restos vegetales y animales al su alrededor que necesitan degradarlos e internalizarlos, por lo que excretan enzimas al exterior con el fin de romper grandes polímeros como almidón y celulosa para posteriormente internalizaros y nutrirse porque al ser muy grandes no pueden ser internalizarlos directamente, deben ser rotos en unidades menores. Es por esto que originalmente utilizan enzimas Biopelículas mixtas: Superficie aeróbica y base anaeróbica. - Biopelículas anaeróbicas : Bacterias fermentadoras, acetogénicas obligadas, metanogénicas, sulfato reductoras - Biopelículas aeróbicas : Bacterias quimiolitótrofas Matriz adhesiva o sustancia polimérica extracelular o glicocalix Agrupamientos de células bacterianas sésiles adheridas a una superficie Se forman canales por donde circulan agua, enzimas, nutrientes, residuos y ayudan a evitar que se desprendan las células superficiales expuestas a corrientes de líquidos. Otros elementos según ambiente.
Composición de biofilm
como el C y N 2 descienden y los desechos se acumulan, es decir, son metabolitos secundarios. Detergentes para el hogar, hidrólisis de almidón, textiles (industria del cuero para ablandarlo), bebidas. Las enzimas de Bacillus toleran las altas T°, un amplio rango de pH, condiciones alcalinas y niveles inhibitorios por producto.
- Proteasas : Son las enzimas de mayor producción en la industria. Función : Atacan las uniones peptídicas de las proteínas formando pre-pptdos pequeños. Propiedad : actúan a casi todos los pHs. Dependiendo el pH, hay distintos tipos de proteasas: serina proteasas, cisteína proteasas, etc. Apps : Industria de lavandería, de limpieza en seco e industria panadera, donde hay que romper estructuras proteicas.
- Amilasas : Función : Hidrolizan el almidón. De acuerdo cómo rompan el almidón y el producto que dejen, existen: o α-amilasas (endomilasas) ; uniones α-1,4 glucosídicas localizadas en la región interna de la molécula de almidón. o β-amilasas (exomilasas) ; hidrolizan uniones α-1,4 de forma alternada, en región externa y producen maltosa. o Glucoamilasa ; produce hidrólisis de uniones externas α-1,4 del almidón y produce β- D-glucosa. o Enzimas desramificantes; hidrolizan específicamente las uniones α-1,6 de amilopectina y glucógeno. o Inulinasas ; producción de jarabes de alta fructosa por hidrólisis enzimática de inulina (polímero lineal de 25-35 fructosas) Apps : Lavandería, cervecería, panadería, papelera, farmacéutica y caramelera. VITAMINAS : Bacillus subtilis y Bacillus cereus
- Nucleósidos de purinas
- Rivoflavinas
- Ácido flutámico
- D-ribosa
- Sustitutos de azúcares de bajas calorías
- Polidrozybutirato MEDICINA :
- Antibióticos : Como bacitracina, gramicidina, polimixina, subtilina.
- Antígenos para vacunas
- Proteínas (humanas): Hormonas de crecimiento, Interferones e Proinsulinas
- Probióticos (p/humanos) AGRICULTURA :
Biocontrol - Bioinsecticida por parte de Bacillus thuringiensis.
Bacillus thuringiensis (Bt) es un bacilo gram+, formador de endosporas en posición terminal o subterminal. Su hábitat es el suelo donde se encuentra como saprófito o en insectos infectados que son plaga, a los que les causa enfermedad letal, insectos pertenecientes a diferentes órdenes como Lepidópteros, Coleópteros y Dípteros, entre otros. Producen cuerpos cristalinos adyacentes a la espora con actividad tóxica (insecticida), los cuales presentan toxicidad para los insectos, también conocidas como proteínas Cry o Cyt o toxinas Bt o proteínas cristalinas/proteína paraesporal/cuerpo paraesporal (δ endotoxina). Éstas son el principal factor de virulencia de Bt y tienen actividad insecticida. La composición química de estos cuerpos parasporales es una agregación de subunidades de una glucoproteína sintetizada durante la fase IV de la formación de la espora. Poseen un peso ~ 120 kDa y se encuentran libre en el citoplasma o englobadas en el exosporio de la espora. Tienen una alta especificidad; distintas cepas pueden producir proteínas con variada especificidad para distintos grupos de insectos.
Los genes cry que codifican para las proteínas cristalinas son conocidos comercialmente como “toxina Bt” y se han introducido en distintos cultivos como maíz y algodón on el objetivo de protegerlos contra el ataque de insectos fitófagos. Es una tecnología amigable con el medioambiente, razón por la cual se ha hecho común el uso y desarrollo de productos comerciales y plantas transgénicas a base de toxinas Cry en el sector agrícola. Las proteínas Cry han sido utilizadas ampliamente como biopesticidas o en el desarrollo de cultivos transgénicos. Las plantas transgénicas resistentes a insectos expresan en sus tejidos las proteínas Bt que, al ser ingeridas por los insectos, son activadas por enzimas intestinales de las larvas (se activan por clivaje en polipéptidos tóxicos en intestino alcalino) y se unen a receptores específicos de las células intestinales. Esto provoca poros en las membranas de las células epiteliales del intestino del insecto con pérdida de cationes, seguido de la pérdida del contenido intestinal del insecto, el cual deja de alimentarse y muere a los pocos días. Cuando las larvas de los insectos plaga que son blanco de esta tecnología se alimentan de tejido de la planta Bt, se mueren. Las proteínas Cry son inocuas para organismos no blanco, como mamíferos, pájaros e insectos benéficos, ya que carecen de los receptores específicos. Modo de acción de proteínas Cry: Cry 1 Cry 3 Cry 4 Actúan mayormente sobre lepidópteros (mariposas) Actúan mayormente sobre coleópteros (vaquitas de san Antonio, escarabajos) Actúan mayormente sobre mosquitos y moscas negras
Beneficios de esta tecnología Bt:
- Mayor rendimiento
- Reduciendo aplicación de insecticidas químicos
- Beneficio directo para el medio ambiente (menos químicos, suelo menos erosionado, menos contaminado con químicos)
- Reducción del daño de insectos en granos
- Reducción en pérdida en la producción
- Granos de mejor calidad
- Menores niveles de micotoxinas Maíz Bt: planta modificada genéticamente mediante biotecnología moderna para defenderse a si misma del ataque de insectos lepidópteros. Utilizando la tecnología de ADN recombinante se modificó el maíz, insertando un gen de la bacteria Bacillus thuringensis (Bt) de tal modo, que sus hojas, tallo y polen expresan la proteína Bt de la bacteria. Biofertilizante y biocontrol:
CULTIVO PURO , tinción de Gram, tinción Verde de Malaquita, prueba de
catalasa: Se seleccionan colonias que luzcan diferente considerando la morfología colonial, el tipo y ubicación de la espora (según tinción de verde de malaquita) y tinción de Gram, y prueba de catalasa. Luego se realizaron estrías por agotamiento en placas de Petri con el medio ETA de las colonias seleccionadas a fin de obtener cultivos puros. Incubación por 18-24hs a 37°C en aerobiosis.
ANÁLISIS DE ACT ENZIMÁTICA (por replica plating) Y ANTIMICROBIANA: Se
realiza la transferencia, por replica plating mediante el empleo de palillos estériles, de las colonias seleccionadas a placas del medio ETA para su posterior análisis de actividad enzimática (placa master). Por otro lado, para det la act antimicrobiana, se sembró una estría central del cultivo de Bacillus en placas de Petri conteniendo agar tripticasa soya (ATS) para luego incubar a 37ºC durante 48 horas que previamente había sido cultivada e incubada en caldo tripticasa soya (CTS) por los docentes. Cada colonia desarrollada en la placa master fue sembrada con palillo estéril en los siguientes medios:
- Medio basal Zhang (MZ) con leche descremada (10 g/l) para la selección de microorganismos caseinolíticos.
- Medio basal Zhang (MZ) con almidón (10 g/l) para la selección de microorganismos amilolíticos.
- Agar yema de huevo, es un medio enriquecido, sólido y diferencial para la selección de microorganismos con capacidad para producir la enzima lecitinasa.
- Agar esterasa con Tween 80 (10 g/l), este medio contiene Tween 80 (detergente) como fuente de carbono, púrpura de bromocresol como indicador de pH y sales de calcio, para la selección de microorganismos productores de enzimas esterasas. Todos estos medios de cultivo se incubaron a 37°C durante 18-24 horas. Además, en la placa con la estría central, luego de inactivar el cultivo por 30 min. con exposición a vapores de cloroformo bajo campana, se sembraron perpendicularmente (a la estría central) pero paralelas entre sí, especies antagonistas (Escherichia coli y Staphylococcus aureus) para el posterior análisis de producción de sustancias antimicrobianas. Estas placas se incubaron a 37ºC durante 48 horas. Se sabe que estos antagonistas en ocasiones pueden producir enfermedades por lo que se realizó la prueba para ver si las cepas de Bacillus elegidas podían inhibir su crecimiento. SIEMBRA Y ANÁLISIS DE PRUEBAS METABÓLICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR: prueba de la catalasa en tubo, Voges-Proskauer, pH en Voges-Proskauer menor que 6, crecimiento en agar anaeróbico, crecimiento a 50°C y a 65°C, crecimiento con NaCl al 7%, producción de ácido y gas con glucosa y reducción del NO3. En la prueba de la catalasa se evalúa la presencia de la enzima catalasa, en este caso se espera que la prueba dé positivo porque los Bacillus son aerobios estrictos o facultativos y poseen dicha enzima que previene la acumulación de peróxido de hidrógeno. La prueba de Voges-Proskauer nos permite detectar la presencia de acetoína, un producto final neutro derivado del catabolismo de la glucosa. En este caso la prueba dio positivo para la colonia 2 lo cual se determinó por la presencia de color rosa en la superficie después de los 15min de la adición de los reactivos. Esto me indica que en presencia de oxígeno y álcali, tanto la acetoína como el 2,3-butanodiol fueron oxidados a diacetilo, que es el compuesto que reacciona para dar el color. La prueba de pH en Voges-Proskauer se basa en la capacidad del microorganismo en realizar fermentación butilenglicólica como proceso metabólico, el producto sería en este caso 2,3 butanodiol que modifican el pH del medio en un valor a 6. La prueba de la reducción del nitrato puede dar negativo si se trata de bacterias aerobias que utilizan al oxígeno como aceptor final de electrones y no al nitrato. O bien dar positivo si se trata de bacterias aerobias facultativas, las cuales pueden usar al nitrato como aceptor final de electrones si realizan respiración anaeróbica. El crecimiento en agar anaeróbico sirve para evaluar si las bacterias pueden crecer en ausencia de oxígeno. En el caso de la colonia 2 dio negativo lo que indica que son bacterias aerobias estrictas.
La prueba del crecimiento a 50°C se realizó para ver si las bacterias eran termófilas donde su temperatura óptima es entre 55-65°C pero en este caso no hubo desarrollo de la colonia 2 por lo que las bacterias son mesófilas. Con el crecimiento a 7% de NaCl se evaluó si las bacterias eran halófilas capaces de crecer en ambientes salinos ya que es una característica que poseen algunos Bacillus pero en este caso no hubo desarrollo. La prueba de ácido y gas con glucosa se evalúa en la prueba es el uso de glucosa en presencia de una fuente nitrogenada inorgánica, si no puede usar esta fuente inorgánica no desarrolla. API50 PARA IDENTIFICACIÓN A NIVEL ESPECIE: También, a partir del aislamiento puro, se realizó una suspensión en caldo nutritivo y se igualó la turbidez al tubo 4 de la escala de McFarland para posteriormente sembrar en agar ETA un volumen de 0,1 ml de la suspensión anterior diseminar con espátula de Drigalsky. Esto se incubó a 37°C durante 18-24 horas. Este cultivo se utilizó para la posterior siembra del API50. Se preparó la cámara plástica donde se colocaron las galerías del sistema comercial API50CH colocándole en los orificios de la base la cantidad necesaria de agua destilada estéril. Finalmente, se sembraron las galerías del sistema comercial API50CH colocándole vaselina estéril en cada cúpula, y se incubó a 37°C durante 48 hs.
