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REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR).
MONSERRAT GUADALUPE ZAVALA CAHUE
JUDITH ALCARAZ SAUCEDO
JOCELYNE CALDERÓN PADILLA 5 °B
YAZMIN ADRIANA GÓMEZ CERVANTES
IVÁN ADALBERTO ROJAS PÉREZ
PERLA YAMIL CUEVAS APARICIO
LESLY ARACELI AREVALO VACA
¿QUÉ ES EL PCR? Algunas veces llamada "fotocopiado molecular", la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) es una técnica de laboratorio rápida y económica utilizada para "amplificar" - copiar - pequeños segmentos de ADN.
¿PARA QUÉ SE UTILIZA LA RCP? El ADN producido por la RCP puede usarse en muchos procedimientos de laboratorio diferentes. Por ejemplo, la mayoría de las técnicas de mapeo en el Proyecto del genoma humano (PGH) dependían de la RCP.
- La RCP también es valiosa en varias
técnicas de laboratorio y clínicas,
incluida la identificación de la huella
genética, la detección de bacterias o
virus (especialmente el del sida), y
el diagnóstico de trastornos
genéticos.
DESNATURALIZACION Temperatura elevada (93- 96 °C) La hebra doble se funde: Se rompen los puente de H y aumenta el numero de bases desapareadas, abriéndose para dar ADN monocatenario, parándose todas las reacciones enzimáticas.
ADN BICATENARIO
ADN
MONOCATENARIO
Depende de:
- Tipo de disolvente
- Concentración salina
- pH utilizado
- Concentración de G/C ( Tf: es mas alta) y T/A (Tf: es mas baja)
EXTENSIÓN DEL CEBADOR Temperatura 72 °C.
- ADN polimerasa termoestable (ADN Taq polimerasa).
- Presencia de dNTP. Cebadores extendidos unas cuantas bases = ATRACCIÓN IÓNICA. Cebadores no correspondidos = Se sueltan (por la temperatura elevada). BASES + CEBADOR Unidos en el extremo 3 ’ del cebador (la polimerasa añade dNTP desde 5 ’ hacia 3 ’, leyendo el ADN molde desde 3 ’ hacia 5 )
- Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde para el ciclo siguiente.
- 1 era ronda = hebras de ADN de diferentes tamaños.
- 2 da ronda= hebras de ADN de longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores.
- La amplificación se expresa con la ecuación: (2n - 2n)x Donde: ✓ n = número de ciclos. ✓ 2 n = número de moléculas del primer producto obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo ciclo con longitud indefinida. ✓ x = número de ejemplares del ADN molde original.
- Al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 2 (a la 20 ) veces, suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %.
RT-PCR Para virus con genoma de ARN.
- Tras aislar y purificar el ARN, se emplea transcriptasa inversa = sintetiza una molécula de ADN complementario que sirve de ADN de partida para la PCR convencional. PCR- anidada Para cuando hay poco ADN especifico (el que se quiere detectar) en la muestra a analizar.
- Emplea 2 parejas de primers ( 1 externa y 1 interna).
- Tras la 1 ra amplificación ( 20 ciclos), el producto se diluye, pudiendo eliminar los inhibidores presentes. PCR multiplex Para detectar en la misma reacción varios patógenos diferentes.
- Emplea diversas parejas de primers, cada una especifico para un virus distinto. qPCR o real time (rt) PCR Monitoriza la amplificación de la molécula de ADN problema durante cada ciclo de amplificación y no al final.
- Gracias a reactivos fluorescentes (fluorocromos) y a termocicladores con sensores. L- PCR O LA-PCR (larga) Para amplificar regiones diana de gran tamaño ( 5 y 40 kb).
- Necesita de Taq polimerasa y Pfu (para mayor actividad
PCR in situ Para detectar pequeñisimas cantidades de genoma.
- Reacción en secciones histológicas o células.
- Realizada en preparaciones fijas en un portaobjetos.
- 1 : amplificación de ADN blanco.
- 2: detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. PCR inversa Para clonar regiones desconocidas de ADN, situadas en posición vecinal a secuencias diana conocidas.
- Se amplifica la región externa, que flanquea a los cebadores. PCR con adaptadores Para región de ADN desconocido.
- Se ligan a sus fragmentos de restricción unos adaptadores oligonucleótidos sintéticos con extremos cohesivos compatibles con los generados en la muestra.
Características importantes
- Un iniciador o cebador se refiere a un número reducido de nucleótidos del ADN, por lo general de 18 a 24 pares de bases de longitud.
- Un cebador puede ser utilizado para muchos procesos experimentales diferentes.
- Se puede utilizar en una reacción de PCR para llegar a un locus determinado y así amplificarlo para su posterior análisis. Es una manera de seleccionar una secuencia muy específica del ADN. Un iniciador o cebador es una secuencia corta de ADN de cadena simple que se utiliza en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el método PCR se emplea un par de cebadores para hibridar con el ADN de la muestra y definir la región del ADN que será amplificada.También se les conoce como oligonucleótidos.
Diseño de los oligonucleótidos iniciadores o cebadores (primers)
- Cada primer individual debe contar con una longitud de 18 a 24 bases.
- Se debe mantener un contenido de G:C (Guanina:Citosina) entre 40 y 60 %.
- Los dos primers del par deben de tener temperatura de fusión “Tm” cercanos, dentro de los 5 °C.
- La secuencia de los primers individuales debe iniciarse y terminarse con 1 o 2 bases púricas.
- Evitar regiones con potencialidad para formar estructuras secundarias internas.
- Evitar poli X.
- Secuencias adicionales pueden ser agregadas en el extremo 5 ’ del primer (no incluir cuando se estima la Tm del primer).
- Se pueden agregar degeneraciones en algunas posiciones del primer:
- Se incrementa el riesgo de amplificación inespecífica.
- Se disminuye la concentración en la mezcla de cada uno de los primers posibles
- No se recomienda utilizar más de 64 primers diferentes en la mezcla.
- Código IUPAC/IUB:
Especificidad Complementariedad de secuencias Longitud Longitud ideal : 18- 24 nt Temperatura de Hibridación Contendido GC Concentración del Cloruro de Magnesio Elección de las enzimas Molde de ADN
