DISEÑO DE PRIMERS PARA PCR EN BACTERIAS, Guías, Proyectos, Investigaciones de Biología Celular

¡Descarga DISEÑO DE PRIMERS PARA PCR EN BACTERIAS y más Guías, Proyectos, Investigaciones en PDF de Biología Celular solo en Docsity!

DISEÑO DE PRIMERS PARA PCR EN

BACTERIAS

PRACTICA 5

ALUMNA: MELANY DENISSE CARMONA SANTANA

PROFESOR: JUAN MANUEL RODRIGUEZ CORONA

MATERIA: BIOLOGIA CELULAR

MATRICULA: 570110062

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar secuencias de ADN. El método utiliza secuencias cortas de ADN llamados cebadores para seleccionar la parte del genoma a amplificar. La temperatura de la muestra se sube y se baja repetidamente para ayudar a la enzima de replicación del ADN a duplicar la secuencia del ADN que está siendo copiada. Con esta técnica se pueden producir un billón de copias de la secuencia en estudio en sólo unas pocas horas. introducción/Antecedentes Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus). T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70 °\text C70°C70, °, start text, C, end text (temperatura a la que la ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas. La Taq polimerasa Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla, generalmente de unos 202020 nucleótidos de longitud. En cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que están diseñados para flanquear la región blanco (la región que debe ser copiada). Es decir, les agregan secuencias que harán que se unan a cadenas opuestas del molde de ADN solo en los extremos de la región a copiar. Los cebadores se unen al molde mediante complementariedad de bases. Cebadores para PCR

Desnaturalización (96 °\text C96°C96, °, start text, C, end text): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso. Templado (555555 - 656565°\text C°C°, start text, C, end text): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla. Extensión (72 °\text C72°C72, °, start text, C, end text): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN. Los pasos básicos son: Los pasos de la PCR

La electroforesis en gel es una técnica en la que una corriente eléctrica impulsa fragmentos de ADN a través de una matriz de gel y los fragmentos de ADN se separan según su tamaño. Típicamente se incluye un estándar, o marcador de peso molecular, para que pueda determinarse el tamaño de los fragmentos en la muestra de PCR. Uso de la electroforesis en gel para visualizar los resultados de una PCR Este ciclo se repite 25 - 35 veces en una reacción de PCR típica, que generalmente tarda 2 - 4 horas, según la longitud de la región de ADN que se copia. Si la reacción es eficiente (funciona bien), puede producir miles de millones de copias a partir de una o unas cuantas copias de la región blanco. Eso es porque no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad, el nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de síntesis de ADN. Hay muchas copias de los cebadores y muchas moléculas de Taq polimerasa flotando en la reacción, por lo que el número de moléculas de ADN casi puede duplicarse en cada ciclo. La siguiente imagen muestra este patrón de crecimiento exponencial.

Aplicaciones de la PCR La PCR se utiliza en muchos laboratorios de investigación, y también tiene aplicaciones prácticas en medicina forense, pruebas genéticas y diagnósticas. Por ejemplo, la PCR se utiliza para amplificar genes asociados con trastornos genéticos a partir del ADN de los pacientes (o de ADN fetal, en el caso de pruebas prenatales). La PCR también puede utilizarse para detectar el ADN de una bacteria o un virus en el cuerpo de un paciente: si el patógeno está presente, es posible amplificar regiones de su ADN de una muestra de sangre o tejido. Otros tipos de PCR PCR anidada: se trata de una variante de la PCR básica que utiliza dos pares de cebadores. En un primer paso, se realiza la amplificación de una región del genoma, para después concretar más la región mediante una segunda amplificación más específica. Esta PCR se utiliza para amplificar fragmentos muy específicos del genoma. RT-PCR: Esta técnica convierte el ARN de una muestra en ADN. Para ello utiliza la transcriptasa inversa, una enzima utilizada por los retrovirus Se utiliza para múltiples objetivos. Genotipar diferentes virus de ARN, como el SARS-Co-V o el VIH. PCR cuantitativa: es una PCR que permite medir en tiempo real la cantidad de fragmentos que se van produciendo. Se utiliza a menudo para analizar la expresión de los genes. PCR múltiple: en este tipo de PCR se realizan amplificaciones simultáneas de más de un fragmento de ADN. Para ello, se utilizan varios cebadores diferentes en una misma reacción. PCR in situ : esta PCR se realiza en células o tejidos. Se utiliza para poder detectar secuencias de ADN en el interior de las células que no son detectables mediante otras técnicas. PCR digital : es una de las últimas generaciones en técnicas de amplificación de ADN. Está basada en la separación de cada muestra en múltiples particiones (microgotas), de forma que la reacción de amplificación se produce de forma independiente cada una de ellas.

Kary Mullis ¿QUIEN ES? Fue su regreso a la ciencia en el sector privado el que le elevaría al cénit de su carrera. En 1983, mientras trabajaba para Cetus Corporation en California, concibió la PCR. Cuatro años después, él mismo relató en Scientific American cómo la idea le sobrevino mientras conducía una noche de abril por las montañas del norte de California. Fabricar millones de copias de un fragmento de ADN de forma rápida y sencilla era algo tan simple en su concepto, y a la vez con un potencial tan inmenso en sus aplicaciones, que el mismo Mullis reconocía que se le podía haber ocurrido a cualquiera. Sin embargo, los obstáculos técnicos eran numerosos, y la clave de su éxito consistió en dar con la idea de utilizar calor para separar las dobles cadenas ya creadas y comenzar de nuevo el ciclo.