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Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero – Julio 2022 (S6) [ REPORTE DE PRÁCTICA ]
“Detección cualitativa de aminoácidos”
[Acevedo Medellín Zaín Antonio, 19310499, L19310499@lapaz.tecnm.mx, E]
[Escobar Ortega Jhoana Gissel, 19310492, L19310492@lapaz.tecnm.mx, E]
[Mendoza Montijo Luisa María, 15310781, L15310781@lapaz.tecnm.mx, E]
[Rodríguez González Sergio, 19310464, L19310464@lapaz.tecnm.mx, E]
M. C. Mauricio Salvador Rodríguez Ojeda
Bioquímica AEJ- 1007
Fecha: 2022 - 05 - 09
Resumen Los aminoácidos, son moléculas orgánicas con un grupo amino en uno de los extremos de la molécula y un grupo carboxilo en el otro extremo, el cual se encuentra unido a un mismo átomo de carbono, difieren entre ellos en sus cadenas laterales, así como sus grupos R. Esta práctica tuvo como objetivo la determinación de los aminoácidos presentes en cinco muestras utilizando métodos de colorimetría como lo son la reacción de Ninhidrina, xantoproteica, Ehrlich y Hopkins-Cole. Utilizando la determinación de ninhidrina, se tuvo un descarte seguro de la existencia de la enzima prolina, obteniendo en esta reacción para todas las muestras una tonalidad púrpura. Para ensayos de xantoproteica, al existir una tonalidad amarilla en el tubo de ensaye dos es posible afirmar la presencia de aminoácidos aromáticos. Con ayuda de la reacción de Ehrlich y dando seguimiento a la reacción anterior esta es positiva para tirosina descartando así el resto de aminoácidos aromáticos. La reacción de Hopkins-Cole no fue realizada, sin embargo, con base en los resultados anteriores es fácil descartar un resultado negativo para presencia de aminoácido de triptófano de acuerdo a los resultados de la reacción de Ehrlich. Con estos resultados nos es posible afirmar que se realizó exitosamente un descarté de aminoácidos utilizando métodos de colorimetría, con lo que es seguro afirmar que en nuestro tubo de ensaye dos había presencia del aminoácido de tirosina. Palabras clave: Aminoácidos, detección cualitativa, ninhidrina, xantoproteica, Ehrlich, Hopkins-Cole
Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero – Julio 2022 (S6) [ REPORTE DE PRÁCTICA ] Introducción y objetivos Las proteínas son polímeros de aminoácidos, en los que cada residuo aminoácido está unido al siguiente a través de un tipo específico de enlace covalente. Los 20 aminoácidos estándar encontrados en las proteínas son a-aminoácidos. Todos tienen un grupo carboxilo y un grupo amino unido al mismo átomo de carbono. Difieren entre ellos en sus cadenas laterales, o grupos R, que varían en estructura, tamaño y carga eléctrica y que influyen en la solubilidad en el agua de los aminoácidos. Casi todos los compuestos biológicos con un centro quiral se presentan en la naturaleza en una sola de sus formas estereoisómeros, sea la D o la L. Los residuos aminoácidos de las proteínas son exclusivamente L-estereoisómeros (Nelson y Cox, 2018). La colorimetría es una de las técnicas mayormente empleados en bioquímica. Está técnica suministra información cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en disolución. Las técnicas colorimétricas se basan en la medida de la adsorción de radiación en la zona visible por sustancias coloreadas. En algunas ocasiones, la muestra que deseamos determinar no posee color por sí misma, en tal caso es preciso llevar a cabo un desarrollo de color que den lugar a sustancias coloreadas con la muestra que intenta estudiar (Aparicio, 2017). La presencia de algunos aminoácidos es detectada cualitativamente, debido a que el grupo característico reacciona con compuestos formando así sustancias coloreadas. Hay una gran variedad de reacciones utilizadas para la determinación cualitativa de los aminoácidos, una de ellas es la reacción de la ninhidrina, la cual consiste en la descarboxilación y desaminación del aminoácido por parte de la ninhidrina, donde la versión reducida de la ninhidrina que es formada reacciona con la molécula no reducida junto con el amoniaco resultado de la desaminación, con la finalidad de formar un compuesto con una coloración violeta, sin embargo algunos aminoácidos como la prolina dan como resultado a esta reacción una coloración amarilla (Tejión, 2017). Otra de las reacciones utilizadas es la reacción xantoproteica, la cual se lleva a cabo mediante una nitración del anillo bencénico, añadiéndose el ácido nítrico concentrado y el NaOH a la muestra, observándose los productos de un color amarillo esto por la formación de nitrocompuestos aromáticos, por lo que, los aminoácidos reconocidos pueden ser la tirosina, fenilalanina y el triptófano (Véjar, 2010). Por otro lado, también está la reacción de Ehrlich, donde la presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados encontrados en las cadenas laterales de los aminoácidos, identificados al añadir ácido sulfanílico y nitrito de sodio, formándose sales de
Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero – Julio 2022 (S6) [ REPORTE DE PRÁCTICA ] Resultados A. Reacción de la ninhidrina Al medir el pH en los 5 tubos de ensaye con diferente solución de aminoácido, se obtuvo: Tabla 1. pH de los 5 aminoácidos. No. tubo pH 1 5 2 6 3 4 4 4 5 5 Después de llevar a ebullición los 5 tubos de ensaye, se obtuvieron los siguientes cambios colorimétricos: Tabla 2. Colores obtenidos en la reacción de la ninhidrina en 5 soluciones diferentes de aminoácidos. No. tubo Color obtenido 1 Púrpura 2 Púrpura 3 Púrpura 4 Púrpura 5 Púrpura mayormente intenso B. Reacción xantoproteica Después de agregar el hidróxido de sodio en el último paso de la reacción xantoproteica se obtuvieron los siguientes cambios: Tabla 3. Colores obtenidos mediante el uso de una reacción xantoproteica en 5 aminoácidos distintos. No. tubo Color obtenido 1 - 2 Amarillo 3 - 4 - 5 - C. Reacción de Ehrlich Al finalizar la reacción de Ehrlich, se observaron algunos cambios, donde se obtuvieron los siguientes colores: Tabla 4. Colores obtenidos mediante el uso de una reacción de Ehrlich en 5 aminoácidos distintos. No. tubo Color obtenido 1 Amarillo 2 Rojo 3 Amarillo 4 Amarillo 5 Amarillo D. Reacción de Hopkins-Cole En esta cuarta y última etapa de la práctica no se obtuvieron resultados, esto debido a que no se alcanzó a terminar todo el procedimiento descrito en la sección anterior de materiales y métodos.
Instituto Tecnológico de La Paz Departamento de Ingenierías, Ingeniería Bioquímica «Ciencia es verdad, técnica es libertad» Enero – Julio 2022 (S6) [ REPORTE DE PRÁCTICA ] Discusión Con base en lo mencionado por Stryer, Berg y Tymoczko (2020), existen aminoácidos que poseen cadenas laterales cuyo estado de ionización cambia según el pH del medio, por ende, la forma zwitteriónica predomina en las proximidades del pH fisiológico, cuyo valor aproximado es entre 4 y 7. Como podemos observar en la tabla 1, el pH de cada aminoácido estuvo dentro del rango, por lo que no fue necesario ajustarlo. Según Vázquez, et al. (2014), todas aquellas sustancias que presentan grupos carboxilos y aminos libres son capaces de reaccionar con la ninhidrina. El calentamiento con ninhidrina de aminoácidos produce un color púrpura intenso, denominado púrpura de Ruhemann (Battaner, 2013), como se muestra en la tabla 2, en todos los tubos de ensaye se mostró la positivada, debido a que se manifiesta la presencia de aminoácidos por la coloración violeta, sin embargo, los aminoácidos tales como la prolina, no poseen un grupo amino sino imino, el cual genera un complejo amarillo característico que sirve de ensayo específico para este aminoácido. Para esta prueba, no fue observado en ningún tubo de ensaye una coloración amarilla, por lo cual es posible descartar con certeza la prolina en las soluciones de aminoácidos dadas. De acuerdo a Vázquez, et al. (2014), en una reacción xantoproteica, el ácido nítrico reconoce los aminoácidos que poseen el grupo bencénico (tirosina, fenilalanina, triptófano). La positividad se reconoce por la aparición de un color amarillo o verde debido a la formación de nitrocompuestos, de forma que para los resultados obtenidos, vistos en la tabla 3, es posible afirmar que la solución de aminoácidos presente en el tubo de ensaye dos, contenía aminoácidos aromáticos, sin embargo, cabe destacar que la fenilalanina no genera cambios de coloración en este tipo de prueba, de modo que se trata de los aminoácidos tirosina o triptófano. Como se puede observar en la Tabla 4, de los resultados obtenidos en la reacción de Ehrlich, se destaca al ser diferente el tubo 2 con un color rojo a diferencia de los demás de color amarillo, y tal como menciona Giraldo et al. (2010), es un indicador positivo, debido a que este tipo de reacción al añadirse ácido sulfanílico y nitrito de sodio reaccionando con el aminoácido forman sales de diazonio de un color rojo, principalmente identificando tirosina e histidina (King, 2010), sin embargo el aminoácido número 2 da indicios de ser tirosina, debido a que la solución del tubo dio positivo tanto a la reacción de Ehrlich como a la reacción xantoproteica. Aunque la etapa 4 de la práctica no se pudo realizar y por ende no se obtuvieron resultados, de haber dado algún tubo positivo en la reacción de Hopkins-Cole, de acuerdo con literatura consultada
