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Laboratorio de Diagnóstico Clínico. 2º curso U.T. 12 - 4 Bloque temático III
Gustavo A. Díaz Martín Profesor Técnico de Formación Profesional Curso 2008-
Género Staphylococcus
Taxonomía
El género Staphylococcus ha sido encuadrado recientemente en el Volumen III de la segunda edición del Manual Bergey de Bacteriología Sistemática, en la sección de "Bacterias Gram positivas con bajo porcentaje de contenido en G+C". Este género pertenece a la familia Staphylococacceae, orden Bacillales , clase Bacilli , Phylum Firmicutes. Dentro del género Staphylococcus hay 55 especies y subespecies, siendo las más importantes desde el punto de vista clínico las siguientes:
- Staphylococcus aureus subsp. aureus , (referido en adelante como Staphylococcus aureus )
- Staphylococcus epidermidis , y
- Staphylococcus saprophyticus subsp_. saprophyticus_ El microorganismo más importante por su patogenicidad es Staphylococcus aureus que se caracteriza por poseer una enzima que coagula el plasma: la coagulasa. Esta prueba permite distinguir a S. aureus del resto de especies de estafilococos que aparecen clínicamente, que no poseen dicho enzima. Los estafilococos de interés en patología humana que no pertenecen a ninguna de las especies anteriores se informan en el laboratorio como estafilococos coagulasa negativos (SCN) y aunque son colonizadores habituales del ser humano no producen enfermedad.tan importante como los anteriores.
Patógenos comunes Patógenos infrecuentes S. haemolyticus S. lugdunensis
S. capitis S. saccharolyticus S. warneri
S. hominis S. auricularis S. cohnii
Tabla I: Algunas especies de estafilococos que intervienen raramente en procesos infecciosos humanos.
Algunas especies de géneros diferentes, anteriormente relacionados taxonómicamente, como Micrococcus luteus o Kocuria rosea, que raramente producen infecciones en humanos, tienen características fenotípicas muy similares desde el punto de vista morfológico y bioquímico a los estafilococos, por lo que conviene saber diferenciar ambas especies de las del género Staphylococcus.
Características microscópicas y de tinción
Las bacterias pertenecientes a esta especie son cocos, con forma casi esférica. Forman masas arracimadas, viéndose como bacterias Gram positivas. No tienen flagelos, no forman esporas y excepcionalmente pueden tener cápsula. En los cultivos viejos los estafilococos pueden aparecer como bacterias Gram negativas.
Características de cultivo
Son poco exigentes en sus necesidades; crecen bien en cualquier medio ordinario, aunque lo hacen mejor en los medios enriquecidos. Son aerobios y anaerobios facultativos, con una temperatura óptima de crecimiento entre 30-37ºC. Una particularidad de los miembros de este género es que crecen en medios con una elevada concentración de ClNa que no soportan el resto de los microorganismos (bacterias halófilas). Esto permite la creación de medios de cultivo casi específicos para los estafilococos. Las colonias son visibles fácilmente, sobre todo en agar sangre, con forma redonda y aplanada, bordes netos, superficie lisa y brillante, consistencia variable, sin olor y en algunas ocasiones, hemolíticas. Algunas cepas pueden producir un pigmento carotenoide que les da una coloración amarillenta ( S. aureus ). La producción de este pigmento es mucho más evidente en agar chocolate o a temperatura ambiente. En caso de partir de una muestra con flora polimicrobiana, será conveniente utilizar medios diferenciales o inhibidores que nos permitan evitar el crecimiento de aquellos microorganismos no deseados, o
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visualizar mejor las colonias de S. aureus cuando éstas aparezcan en el medio. Entre los medios específicos para su recuperación tenemos el medio de Chapman , que posee manitol y una alta concentración de ClNa (10%). El ClNa impide el crecimiento de otros microorganismos, y el manitol, al ser metabolizado por el S. aureus , proporciona un pH ácido al medio que provoca el cambio de color del indicador rojo fenol, haciendo que las colonias tengan un color amarillo sobre un fondo rosado (el del medio de Chapman). El medio de Baird-Parker permite el crecimiento de estafilococos y otros gérmenes Gram positivos, presentándose las colonias de S. aureus negras, brillantes, convexas, y rodeadas de un halo brillante de 2 a 5 mm de diámetro. El agar sangre con inhibidores (Acido Nalidíxico) también se utiliza para la recuperación de este microorganismo, apareciendo las colonias de la misma manera que lo hacen en agar sangre. En C.L.E.D. las colonias de S. aureus aparecen con una coloración amarillenta no debida a la pigmentación, sino a la fermentación de la lactosa que lleva incorporada el medio y al cambio de color del indicador. El agar DNasa contiene DNA, y se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa en bacterias. S. aureus producirá una lisis del DNA presente en la placa si posee este enzima, con el consiguiente aclaramiento del medio.
Pruebas bioquímicas para identificación del género Staphylococcus
Además de la tinción de Gram, que debe mostrar un frotis con cocos Gram positivos, arracimados, existen otras pruebas que nos van a permitir identificar correctamente a los miembros del género Staphylococcus. La distinción fundamental debemos hacerla con aquellas bacterias que muestren unas características morfológicas y de tinción semejantes, como son Micrococcus , Kocuria , Streptococcus y Enterococcus. Las dos pruebas más importantes para poder discernir entre los géneros aludidos anteriormente son: Catalasa: La prueba de la catalasa se utiliza para diferenciar microorganismos procedentes de cultivos en los que, al hacer una tinción de Gram, se observan cocos Gram positivos. La prueba de la catalasa es positiva para los géneros Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria y negativa para Streptococcus y Enterococcus , que morfológica y tintorialmente pueden aparecer de forma similar. Lisostafina: La lisostafina es un enzima que rompe la pared de Staphylococcus y no tiene acción sobre Micrococcus / Kocuria ; por esta razón se utiliza para diferenciar estos géneros. En presencia de lisostafina, una suspensión (turbia) de estafilococos acabará lisándose, y por lo tanto perderá esa turbidez inicial. La lisostafina, al no ejercer ningún efecto sobre Micrococcus / Kocuria ; mantendrá la misma turbidez que originalmente tenía la suspensión. Otras pruebas que nos pueden ayudar a diferenciar con precisión entre ambos géneros se muestran en la siguiente tabla:
Staphylococcus Micrococcus / Kocuria
Fermentación de glucosa () (^) + - Lisostafina () (^) S R Lisozima (^) R S Oxidasa modificada (^) - + Sensibilidad a Nitrofurantoína () (^) S R Sensibilidad a Bacitracina () (^) R S Crecimiento anaerobio (^) - +
Tabla II: Diferencias entre géneros Staphylococcus y Micrococcus / Kocuria
* Pruebas importantes que hay que recordar
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varias pruebas (galerías), que permiten obtener una identificación correcta con una menor posibilidad de error, ya que utilizan procedimientos estadísticos e informáticos que calculan la probabilidad de que las pruebas obtenidas puedan corresponder a un microorganismo concreto.
S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus Producción de Coagulasa (^) + - - Sensibilidad a Novobiocina (^) S S R Fermentación de Manitol (^) + - + Fosfatasa (^) + + - Aureasa (^) + - - ß-galactosidasa (^) V+ - +
Tabla III: Diferenciación de especies del género Staphylococcus
Pautas de identificación
Teniendo en cuenta que cada laboratorio puede tener su propia rutina de procesamiento, debemos entender que ésta solo es una de las diferentes pautas que pueden establecerse para la identificación correcta de los estafilococos.
Cocos Gram positivos
Catalasa + - S S R +
Lisostafina Nitrofurantoina Bacitracina Fermentación glucosa
R
R
S
Streptococcus Enterococcus
Género Staphylococcus Micrococcus Kocuria -/+
**-
-**
Coagulasa Proteina A Clumping fact Aureasa
Estafilococos coagulasa negativo S. aureus ßgalactosidasa+ Fosfatasa -
ß galactosidasa - Fostatasa + S. saprophyticu s
S. epidermidis
Tabla IV: Algoritmo de identificación de cocos Gram positivos
En muchos laboratorios donde los medios materiales son escasos, una rutina muy simplificada, pero satisfactoria en la mayoría de los casos, consiste en realizar una prueba de la catalasa y una prueba de la coagulasa a una cepa que haya sido identificada como coco Gram positivo tras la tinción de Gram. Si las dos pruebas son positivas se da como buena la identificación para S. aureus. Si la coagulasa es negativa, se identifica al microorganismo como Estafilococo coagulasa negativo, sin necesidad de llegar más allá en el proceso de identificación. La galería de identificación Rapidec-Staph (de Biomerieux), que vamos a utilizar en las prácticas permite la investigación de las enzimas aureasa, fosfatasa y beta galactosidasa, cuyo conocimiento permite la diferenciación de las especies de estafilococos más frecuentemente aislados en patología infecciosa humana.
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Enfermedades producidas por los estafilococos
Los estafilococos son parte de la flora bacteriana normal de piel, mucosas y tracto respiratorio superior. Sin embargo en determinadas ocasiones son capaces de lesionar gravemente al huésped dando lugar a diversos cuadros infecciosos, entre los cuales destacan:
- Absceso cutáneo: foco localizado de infección en la piel,
- Síndrome de piel escaldada ( dermatitis exfoliativa ),
- Bacteriemia: paso del microorganismo a la sangre a partir de un foco dérmico,
- Endocarditis: infección de válvulas cardiacas,
- Osteomielitis: infección del hueso,
- Neumonía: 2ª a gripe o a bacteriemia,
- Infecciones urinarias: más frecuentes en mujeres,
- Conjuntivitis: infección de la conjuntiva, y
- Síndrome del shock tóxico: en mujeres que utilizan tampones absorbentes. Las toxinas estafilocócas responsables de la mayor parte de los efectos perjudiciales de estos gérmenes sobre el huésped son:
- Hemolisinas y leucocidina (actúan sobre células sanguíneas)
- Enterotoxinas (responsables de las toxiinfecciones alimentarias)
- Exfoliatina (responsable del síndrome de piel escaldada)
- Exotoxinas pirógenas (productoras de hipertermia)
- Enzimas estafilocócicas: Coagulasa, hialuronidasa y estafiloquinasa. La inmunidad que dejan las infecciones estafilocócicas es generalmente escasa y poco duradera.
Susceptibilidad antimicrobiana de los estafilococos
En general, los estafilococos son microorganismos bastante sensibles a la mayoría de los antimicrobianos tradicionales. Sin embargo la aparición de resistencia ante un antibiótico parece extenderse a todos los demás, resultando algunas cepas resistentes a la mayoría de los antimicrobianos utilizados. La presencia de un enzima ß-lactamasa (codificada y trasmitida mediante plásmidos), condiciona la resistencia de estos microorganismos a todos los antibióticos beta lactámicos (penicilina y derivados). La aparición de penicilinas que resistían la acción de las beta lactamasas, como oxacilina o meticilina, pareció solucionar el grave problema que representaba la inutilidad terapéutica de la penicilina G. En la actualidad se utilizan sustancia s no antibióticas que se unen irreversiblemente a las beta- lactamasas impidiendo su acción posterior. Son el ácido clavulánico y el sulbactam. Sin embargo, en estos últimos años ha aparecido en España un aumento de resistencia de los estafilococos a la meticilina, considerándose un grave problema a nivel hospitalario. Estas cepas se denominan MRSA ( Staphylococcus aureus meticilin resistentes). Antibióticos tradicionales tales como vancomicina o lincomicina siguen siendo buenas opciones para el tratamiento de las infecciones producidas por estos microorganismos. Sin embargo nuevas moléculas como roxitromicina o teicoplanina aparecen para aliviar la presión que sufren los hospitales ante este aumento de resistencias a los antibióticos comúnmente utilizados. El siguiente cuadro resume la susceptibilidad actual de S. aureus a los antimicrobianos más importantes:
Resistencia <10% Resistencia variable Resistencia > 90%
Oxacilina Clindamicina Vancomicina Imipenem
Ciprofloxacino Gentamicina Amikacina Cloranfenicol
Eritromicina Tetraciclina Cefalosporinas Meticilina
Penicilina G Ampicilina Aztreonam
Tabla V: Patrón de sensibilidad de Staphylococcus aureus a antimicrobianos
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Características microscópicas y de tinción
Los miembros de estos géneros son bacterias cocoides Gram positivas que generalmente se presentan formando cadenas de longitud variable, sobre todo cuando se cultivan en medios líquidos. En ciertas condiciones de crecimiento las células bacterianas pueden alargarse, semejando bacilos al microscopio. Cuando se realiza una tinción a partir de una colonia procedente de un medio sólido, es muy frecuente ver agrupamientos en forma de racimos, lo cual deberemos tener muy en cuenta para no caer en la tentación de identificarlos rápidamente como estafilococos. Los estreptococos no tienen flagelos ni forman esporas, aunque frecuentemente pueden presentar
una cápsula.
Caracteristicas macroscópicas y culturales
Son aerobios y anaerobios facultativos, creciendo ligeramente mejor en atmósfera de CO 2 al 10%. Crecen bien a 35-37ºC, aunque algunas especies pueden hacerlo perfectamente entre 10 y 50ºC. Los miembros del género Streptococcus son muy exigentes en cuanto a requerimientos nutritivos, necesitando casi siempre sangre entera o calentada para su crecimiento. En estos medios crecen lentamente, formando colonias muy pequeñas, apenas visibles a simple vista, planas, consistentes, que suelen acompañarse de halos hemolíticos alfa o beta. Sin embargo, las especies del género Enterococcus , son menos exigentes, pudiendo desarrollarse en medios carentes de sangre. En ocasiones se emplean caldos selectivos de enriquecimiento para potenciar el crecimiento de esta flora y disminuir el de la acompañante. ( P. ej.: Todd Hewitt, bio-Streptosel, caldo SF, etc.). Pueden utilizarse también medios inhibidores compuestos por agar enriquecido mas antibióticos que impidan el crecimiento de otros gérmenes. Un medio muy utilizado es el agar sangre CNA (con base Columbia o TSA y Ac. nalidíxico y Colistina). En estos últimos años se han desarrollado medios selectivos para el aislamiento de estreptococos beta hemolíticos de los grupos A y B, por ejemplo el medio SSA de B&D. También existen medios de aislamiento que incorporan un sustrato susceptible de ser hidrolizado por la esculinasa (beta glucosidasa) de los enterococos, y así ponerlos de manifiesto sin necesidad de más pruebas adicionales (p. ej. medio CPS de Biomerieux).
Especies importantes de los géneros Streptococcus y Enterococcus
De las 99 especies que componen el género Streptococcus, solo cuatro tienen una importancia clínica significativa: Hay otras especies de estreptococos menos significativos que se agrupan con la denominación de Estreptococos del grupo viridans. Las especies más significativas de cada grupo son:
Los más importantes Grupo viridans Grupo milleri o intermedius: Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Streptococcus bovis Streptococcus pneumoniae Estreptococos Grupo viridans
Streptococcus mitis Streptococcus mutans Streptococcus oralis Streptococcus sanguis Streptococcus salivarius Grupo milleri o intermedius
Streptococcus intermedius Streptococcus constelatus Streptococcus anginosus
Los enterococos más importantes son: Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium
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Clasificación de los estreptococos
Los estreptococos se clasifican de muy diversas formas, según sea el objetivo y necesidad de dicha clasificación. Existen tres que resaltan sobre las demás:
- Según el tipo de hemolisis producida:
alfa beta gamma Streptococcus pyogenes No Siempre No Streptococcus agalactiae No Generalmente A veces Streptococcus bovis A veces A veces Generalmente Streptococcus pneumoniae Siempre No No Estreptococos Grupo viridans Generalmente No No Enterococcus faecalis Rara vez A veces Generalmente
- beta hemolíticos.- Producen hemólisis total; son los más patógenos:
- alfa hemolíticos.- Producen hemólisis parcial. También son patógenos
- no hemolíticos.- Casi siempre comensales o transeuntes.
- Según sus antígenos específicos ( grupos de Lancefield): Los estreptococos poseen unos antígenos específicos de naturaleza hidrocarbonada, que pueden ser puestos de manifiesto mediante diversas técnicas inmunológicas, como la aglutinación. Los antígenos se nombran con letras del alfabeto correlativas desde la A hasta la V. Además existe un grupo denominado de estreptococos no agrupables donde se incluyen aquellas especies en las que no ha podido ser demostrado ninguno de estos antígenos. Los grupos antigénicos más importantes son los grupos A, B y D, seguidos de C, F y G. Algunos estreptococos, como S. pneumoniae no poseen antígenos de Lancefield demostrables.
Los estreptococos no agrupables y alfa hemolíticos se conocen con el nombre de estreptococos viridans, denominación que no identifica a una especie sino a un conjunto de ellas.
- Según sus diferencias fisiológicas y bioquímicas: Aquí tendríamos que establecer las diferencias entre las 65 especies que componen este género. Para ello se utilizan galerías de identificación específicas, como la galería API Strep que posee más de 20 pruebas bioquímicas y permite la diferenciación de cocos Gram positivos catalasa negativos.
A pesar de lo complicado que pueda parecer, existe una gran correlación entre las tres clasificaciones. Ciñéndonos exclusivamente a las especies que más nos interesan vamos a ver cómo quedaría esta clasificación conjunta:
Antígeno Especies Hemólisis Grupo A S. pyogenes ß hemolitico siempre Grupo B S. agalactiae ß hemolítico, generalmente Grupo D E. faecalis No hemolítico, generalmente Grupo D S. bovis No hemolítico, generalmente No agrupable S. pneumoniae alfa hemolítico, siempre No agrupable Estreptococos grupo viridans alfa hemolítico generalmente Agrupable o No Estreptococos grupo milleri alfa, ß o no hemolítico
Tabla 2: Comparación de las clasificaciones de Streptococcus y Enterococcus
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Susceptibilidad a agentes antimicrobianos
Los estreptococos son generalmente sensibles a penicilina, salvo los enterococos, que aparecen como resistentes o moderadamente sensibles a ella. Aunque en terapéutica se utiliza mucho la combinación de penicilina mas un aminoglucósido para el tratamiento de las infecciones por estreptococos (enterococos y viridans sobre todo), en la práctica solo se busca el sinergismo de ampicilina con gentamicina a la hora de realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. En pacientes alérgicos a la penicilina, se puede utilizar eritromicina como agente de segunda elección, por lo que debe buscarse la sensibilidad de los microorganismos ante este agente. Los enterococos son particularmente resistentes a cefalosporinas, por lo que la aparición de sensibilidad ante cualquiera de estos agentes debe hacer sospechar de la correcta identificación o de la realización del antibiograma.
Sensibles Resistentes
Estreptococos grupo A Penicilina G Eritromicina
Estreptococos grupo B Ampicilina + Gentamicina
Otros estreptococos ß hemolíticos (C,F,G)
Penicilina, Ampicilina Tetraciclina
Estreptococos Grupo D Penicilina
S. pneumoniae Penicilina
S. viridans Penicilina
Enterococos (^) CefalosporinasPenicilina
Tabla 4: Sensibilidad de los estreptococos a los antimicrobianos
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Enfermedades producidas por los estreptococos
Las patologías producidas dependen generalmente de la especie, por lo que pasaremos revista a cada uno de los grupos más importantes.
- Estreptococos del grupo A ( S. pyogenes ).-
- Infecciones cutáneas: superficiales : pioderma estreptocócico impétigo contagioso profundas: erisipela heridas infectadas
- Infecciones del tracto respiratorio: Faringitis, otitis, sinusitis, bronquitis y neumonías. Escarlatina ( toxina eritrogénica ).
- Secuelas no supurativas: Fiebre reumática: artritis, carditis, glomerulonefritis, corea
- Estreptococos del grupo B ( S. agalactiae ).-
- Infecciones genitales
- Infecciones perinatales ( meningitis, endocarditis, sepsis...)
- Streptococcus pneumoniae ( no agrupable ).-
- Neumonía ( causa más importante )
- Meningitis
- Conjuntivitis
- Otitis media y bacteriemia en niños
- Enterococos ( Enterococcus faecalis ).-
- Endocarditis
- Infecciones del tracto urinario
Otros datos de interés
Los estreptococos de los grupos A, C y G producen una hemolisina denominada estreptolisina que tiene poder inmunógeno. La valoración de los anticuerpos anti estreptolisina es útil para seguir la evolución de las infecciones estreptocócicas. Hay dos tipos de estreptolisinas: la estreptolisina O, que es oxígeno lábil y la estreptolisina S, que es oxígeno independiente. Si sembramos una placa en aerobiosis corremos el riesgo de inhibir la hemólisis dependiente de la estreptolisina O, visualizando solo la debida a la estreptolisina S.
