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Apuntes de Bioensayos.
1.- INTRODUCCIÓN Y PRINCIPIOS GENERALES.
Características generales del curso
1.1.1. Propósito y entrega de temario y calendario de prácticas de laboratorio.
1.2. Conceptos Básicos. Que es un Bioensayo?? Un bioensayo es el uso de un organismos VIVO como un agente de prueba para la presencia o concentración de un compuesto químico o un efecto ambiental.
1.2.1. Diseño Experimental. Un experimento es una investigación planeada para descubrir nuevos hechos o para confirmar o negar los resultados de investigaciones previas. En un experimento se manipulan deliberadamente una o más variables independientes (supuestas causas) para analizar las consecuencias que la manipulación tiene sobre una o más variables dependientes (supuestos efecto), dentro de condiciones controladas por el investigador.
El diseño experimental, es el proceso de planeamiento de un experimento, tal que se tomen datos apropiados con la mayor realidad posible, los cuales deben ser analizados mediante métodos estadísticos que deriven conclusiones válidas y objetivas. Podemos decir que la filosofía del diseño experimental es la obtención de información con una alta fidelidad sobre el mensaje de la naturaleza a un costo mínimo. Los diseños experimentales deben tener algunas características como:
1. Simplicidad. La selección de los tratamientos y la disposición experimental deberá hacerse de la forma más simple posible. 2. Grado de precisión. El experimento deberá tener la capacidad de medir diferencias entre tratamientos con los grados de precisión que desee el investigador. Para cumplir con este propósito se deberá partir de un diseño y un número de repeticiones adecuados. 3. Ausencia de error sistemático. Se debe planear un experimento con el propósito de asegurar que las unidades experimentales que reciban un tratamiento no difieran sistemáticamente de aquellas que reciben otro tratamiento, procurando de esta manera obtener una estimación insesgada del efecto de tratamientos. 4. Rango de validez de las conclusiones. Este deberá ser tan amplio como sea posible. Los experimentos que contribuyen a aumentar el rango de validez del experimento son los experimentos replicados y los experimentos con estructuras factoriales. 5. Cálculo del grado de incertidumbre. En todo experimento existe algún grado de incertidumbre en cuanto a la validación de las conclusiones. El experimento deberá ser concebido de modo que sea posible calcular la probabilidad de obtener los resultados observados debido únicamente al azar.
1.2.2. Organismo de Prueba. La elección de un organismo de prueba adecuado para un Bioensayo depende del efecto que se desea evaluar y de las características del organismo, por ejemplo, un canario es un organismo adecuado de un bioensayo para detectar gases tóxicos o falta de
Cualquier objeto orgánico o inorgánico donde se van a aplicar los
diseños experimentales con el fin de observar una respuesta,
Compuestos químicos, extractos, fuente de compuestos o materia que
pueden generar una respuesta biológica en los organismos de un
ecosistema. Puede ser material de prueba, el sedimento marino,
pesticidas, materia orgánica
1.2.3. Aplicación del análisis Estadístico. En esta etapa se selecciona la(s) variable(s) respuesta(s) o variable (s) dependiente(s). El experimentador debe estar seguro que la respuesta que se va a medir realmente provee información útil acerca de la investigación. Cada respuesta medible, está representada matemáticamente en un modelo lineal. La idea general de un modelo es expresar las observaciones generalmente denotadas por , en términos de “efectos'' que contribuyen a. Esos efectos se pueden clasificar en tres categorías: Efectos de Tratamiento, Efectos de Diseño y Efectos de Error. Los efectos de tratamientos , son un reflejo del efecto de diseño como también de los tratamientos simples o combinaciones de factores. Los efectos de diseño , son determinados por el diseño de control de error, en particular, efectos debidos a las varias clases de bloqueo. Los efectos de error , representan diferentes clases de variación aleatoria. Estos son: (1) el error experimental y (2) el error observacional. Error Experimental. Una característica de todo material experimental es la variación. Asociada con la unidad
experimental está el error experimental, este error es el reflejo de que las UE no son iguales. También podemos decir que es una medida de la variación existente entre las respuestas de las UE tratadas en forma similar. Contribuyendo al error experimental están:
a) El error de tratamiento , el cual resulta de cualquier falta de uniformidad en la realización física del experimento o en la replicación de un tratamiento. Por ejemplo, si se van a administrar 20 ppm de cierta sustancia, administramos 19 ó 21 ppm.
b) El error de estado .o variabilidad inherente al material al cual se aplican los tratamientos, el cual es debido a los cambios aleatorios en el estado físico de una UE. Por ejemplo, en un experimento de nutrición con camarones como material experimental, los individuos tendrán constitución genética diferente, ésta es una variabilidad inherente al material experimental o error de estado. Las camarones se colocarán en jaulas sujetas a diferencias de calor, luz y otros factores; esto constituye una falta de uniformidad en la realización física del experimento o error de tratamiento.
Al hacer inferencia estadística, ya sea por intervalos de confianza o pruebas de hipótesis, la magnitud del intervalo de confianza y el poder de la prueba estadística dependen en definitiva del estimador de la varianza del error experimental, llamado cuadrado medio del error,
. Así que para obtener intervalos cortos o alto poder la prueba se debe hacer todo esfuerzo posible para reducir el error experimental. Para lograr lo anterior debemos:
ver con la variabilidad aleatoria entre las unidades experimentales, la cual puede ser bastante grande. El error experimental no puede detectar sesgos; estima la precisión o la repetibilidad de las medidas, pero no estima la exactitud. Error Observacional. Se considera como parte del error observacional el error de medida , es decir, el error debido a la imprecisión de la medida o procedimiento de detección (aparatos) y el error de muestreo debido a la selección de las UE para la investigación.
1.3. Panorámica de la Aplicación del Bioensayo en problemas relacionados con la bioprospección en el medio marino.
La evaluación de sustancias bioactivas o de condiciones ecotóxicas requiere de la medición de una multiplicidad de parámetros que se deben de tomar de manera y en cantidad suficiente para que permitan extraer conclusiones a través de un análisis estadístico correcto. A pesar de que en el mar viven unas 500,000 especies lo que representa casi el 75% del total de especies del planeta, el número de sustancias bioactivas, conocidas, de origen terrestres superan considerablemente a las de origen marino. Esta diferencia se puede deber a que el medio marino es mucho mas homogéneo que el ambiente terrestre, principalmente en factores como la disposición de luz, nutrientes y temperatura, sus variaciones no son tan drásticas y probable la necesidad de generar sustancias para afrontar adversidades y competencia es menor en el medio marino. También es probable que el potencial de sustancias bioactivas del medio marino se encuentre subevaluado debido principalmente a la dificultad de acceso al medio marino, lo que se ha ido solucionando con los avances en técnicas de buceo y de inmersión submarina.
La gran variedad de organismos que habitan en mares y océanos y las posibles propiedades farmacológicas y médicas de sus extractos, hacen del medio marino una fuente potencial de fármacos y un campo abierto a la investigación en farmacognoscia marina (DE LARA-ISASSI et al ., 1989). A pesar de que en cantidad la lista de sustancias de origen marino es menor a las de origen terrestre, en calidad hay muchos ejemplos de sustancias; la saliva que el pulpo emplea para inmovilizar cangrejos contiene un poderoso estimulante cardiaco llamado 5-HT, Las microalgas generan toxinas muy potentes, el fluido corporal del cangrejo cacerola inhiben el crecimiento de bacterias coliformes, experimentación exploratoria en este mismo curso de Bioensayos ha demostrado que la tinta del Invertebrado conocido como “Vaquita” Aplysia californica inhibe significativamente el crecimiento de bacterias coliformes, las esponjas producen Ectionina que es un antibiótico de amplio espectro, la holoturina de los pepinos de mar es un bloqueador nervioso. Además de los organismos marinos, en general el agua de mar es un suero biológico que además de contener sales disueltas contiene una gran cantidad y variedad de materia orgánica entre esta materia se encuentran disueltas hormonas, enzimas, toxinas y esteroides principalmente, lo que hace del agua de mar un medio que inhibe y promueve reacciones bioquímicas.
2. BIOÉTICA Según la Encyclopedia of Bioethics (Nueva York 1978, vol. I, p. XIX) la bioética es el "estudio sistemático de las ciencias de la vida y del cuidado de la salud, examinada a la luz de los valores y de los principios morales".
"...una primera aproximación -que podríamos llamar periférica- a la
bioética, como conjunto de temas atravesado por el cuestionamiento a la idea del avance tecnocientífico como progreso lineal de la humanidad. Esta
- Vigilar la efectividad de un proceso de remediación o biorremediación.
- Vigilancia para asegurar el cumplimiento de parámetros estatales y federales de calidad ambiental. Estas acciones se pueden aplicar en:
- Toma de decisiones de corporativos industriales y/o compañías biomédicas en el desarrollo, manufactura y comercialización de nuevos productos.
- Cumplir requisitos de regulación para registrar nuevos productos o procesos.
- Obtener permisos de descarga.
- Evaluación de riesgo ambiental.
- Elementos de cargo o descargo en litigios.
- Fuente de datos de calidad del medio ambiente para proteger organismos de futuras afectaciones. CONTRAS. La principal desventaja de un bioensayo es que sus resultados, difícilmente, generan información especifica de un compuesto, causa o condición ambiental. Durante el desarrollo de los bioensayos los organismos de prueba son sometidos a diferentes condiciones experimentales en las cuales se incluye la muerte del organismo como un efecto normal y el problema es que las causas de este efecto pueden ser muchas y difíciles de detectar por medio de un Bioensayo como para decir que en este proceso, valió la pena el sacrificio del organismo.
En evaluación ambiental, la presencia o sobre vivencia de una especie u organismo en un medio ambiente nos indica que este ecosistema le provee lo necesario para solventar sus necesidades, PERO la ausencia de un organismo en un ecosistema NO
necesariamente significa lo contrario o sea que el ecosistema no le provea lo necesario.
2.2. 2.3. El Derecho de los animales a no ser usados en la investigación Biomédica. Y El Derecho del hombre a utilizar organismos para experimentación.
La Asociación Médica Mundial afirma que el uso de animales en la investigación biomédica es esencial para el progreso médico, y a pesar que se dice que en la experimentación con animales deben de cumplirse las normas que rigen el trato compasivo de los animales, esto no se cumple o de la misma manera sigue afectando al organismo. Ya que al estar experimentando con animales y producir alguna lesión es un proceso traumático aunque se utilicen anestésicos ya que al terminar el efecto les producen dolor y se ven afectados en la disminución de peso. Así mismo, el impacto de estrés sobre los mecanismos fisiológicos se ha estado analizando al igual que el miedo, que tan solo con sentir el acercamiento del hombre les causa miedo, una posible solución sería tener un mayor acercamiento a los organismos para que mitiguen el miedo ante la presencia humana. Se conoce que la bioética tiene por objeto material los actos humanos que suponen una intervención sobre la vida (no sólo humana sino también animal y vegetal) para considerarlos bajo el punto de vista formal de la ética, a saber, conocer si son buenos o malos para guiar su obrar. Puesto que el número de animales que padece sufrimiento por su empleo en la investigación representa un bajo porcentaje de las muertes animales por actividades humanas causadas por pesticidas, deforestación, construcción civil, maltrato, entre otras, el sacrificio animal dirigido a la investigación científica es solo una pequeña parte de las perdidas comparadas a las actividades humanas. Lo cual pudiese fundamentar el derecho de los humanos a usar animalitos u otros seres vivos.
"aquellos procedimientos llevados a cabo con fines educativos o de entrenamiento … se deben restringir a los absolutamente necesarios para los fines relativos a la enseñanza y el entrenamiento y se permitirán únicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos por métodos audiovisuales u otros que sean suficientemente efectivos".
En las legislaciones relacionadas con la protección de los animales de todos los países se considera fundamental aplicar el principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (1). Este principio nos indica la necesidad de Reemplazar los animales de experimentación por otros métodos, siempre que sea posible y que el nuevo método nos aporte el mismo grado de información.
En el caso de la docencia e investigación se plantea el reemplazo de los animales de experimentación por otros métodos. Entre los métodos propuestos se pueden citar: a) modelos, maniquíes y simuladores mecánicos; b) películas y vídeos; c) simulaciones de computadora y sistemas de realidad virtual; d) autoexperimentación en el propio individuo; e) experimentos con plantas; f) uso de material procedente de mataderos; g) estudios in vitro con líneas celulares y h) aprovechamiento de animales muertos de forma natural o utilizados después de un procedimiento científico.
3. RESPUESTA BIOLÓGICA A LAS SUSTANCIAS BIOACTIVAS
3.1. Composición y propiedades fisicoquímicas de las membranas.
La membrana celular está constituida de lípidos y proteínas. La parte lipídica de la membrana está formada por una película bimolecular que le da estructura y constituye una barrera que impide el paso de substancias hidrosolubles.
Las proteínas de la membrana están suspendidas en forma individual o en grupos dentro de la estructura lipídica, formando los canales por los cuales entran a las células, en forma selectiva, ciertas substancias.
La selectividad de los canales de proteínas le permite a la célula controlar la salida y entrada de substancias así como los transportes entre compartimentos celulares. Las proteínas de la membrana no solo hacen que el transporte a través de ella sea selectivo, sino que también son capaces de llevar a cabo transporte activo (transferencia en contra del gradiente de concentración).
Las demás funciones de la membrana, como son el reconocimiento y unión de determinadas substancias en la superficies celular están determinadas también por la parte proteica de la membrana. A estas proteínas se les llaman receptores celulares. Los receptores están conectados a sistemas internos que solo actúan cuando la substancia se une a la superficie de la membrana. Mediante este mecanismo actúan muchos de los controles de las células, algunos caminos metabólicos no entran en acción a menos que la molécula "señal", por ejemplo, una hormona, haya llegado a la superficie celular.
En la membrana se localizan unas glicoproteínas que identifican a otras células como integrantes de un individuo o como extrañas (inmunoreacción). Las interacciones entre las células que conforman un tejido están basadas en las proteínas de las membranas.
Resumiendo, la estructura de las membranas depende de los lípidos y las funciones dependen de las proteínas.
3.2. Procesos de entrada de sustancias a través de membranas
Absorción
La Endocitosis
Difusión Facilitada
3.3 Factores inherentes a los principios activos que influyen en el efecto farmacológico.
Las propiedades fisicoquímicas de los Xenobioticos Pequeño radio atómico o molecular Grado de ionización Coeficiente de partición Pka Tamaño Lipofilicidad Solubilidad En general pasan mas fácilmente moléculas de bajo peso molecular, neutras y lipofílicas.
La absortividad de ácidos y bases débiles depende de su estado de ionización y por lo tanto del pH y Pka. Se transportan más fácilmente las formas no disociadas. La cantidad absorbida depende de la velocidad de absorción y del tiempo de residencia del agente en la superficie de transporte.
Los xenobióticos se pueden ligar reversiblemente a las proteínas plasmáticas, por medio de distintos tipos de uniones: interacciones hidrófobas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals. La molécula de proteína tiene un número limitado de sitios donde se pueden ligar, tanto los xenobióticos, como los compuestos endógenos. Así que, un agente determinado tiene que competir con los demás compuestos (xenobióticos y/o endógenos) por los sitios de unión disponibles. La unión reversible del compuesto a las proteínas impide la difusión simple pero no limita su transporte activo.
3.5. Modelos que explican la absorción, distribución, biotransformación y excrecion de sustancias por los organismos.
3.5.1. ADBE. Adsorbción. Distribución Biotransformación Eliminación.
3.5.2. ADME Adsorción Distribución Metabolismo Eliminación Los modelos ADBE y ADME representan la cinética de transferencia de xenobióticos en un organismo y su efecto farmacológico, a traves del estudio de estos modelos se generan las terapias correspondientes para eliminar su efecto.
La interacción dinámica de todos los procesos que constituyen el ADME, determina el tiempo que permanecerá un agente dentro del
organismo después de que éste ha sido expuesto a una dosis determinada. Al estudio de la velocidad de cambio de la concentración de las especies tóxicas dentro del organismo se le conoce como toxicocinética. Las tasas de cambio que se presentan en cada fase del ADME se pueden modelar matemáticamente e integrarlas en un modelo que represente la dinámica global del tóxico dentro del organismo. Cada proceso, sea este de cambio de lugar y/o de identidad química, se puede representar por una ecuación diferencial en la que la derivada de la concentración con respecto al tiempo en un sitio determinado, se expresa como una función de la concentración en ese lugar. La constante de proporcionalidad se denomina velocidad específica y normalmente se representa por la letra "k". (http:// superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-5.html) Podemos representar al cuerpo por un modelo de un solo compartimiento que sigue una cinética de primer orden si se supone que se llega rápidamente al equilibrio en la interface sangre-tejido. En este caso, el cambio de concentración en plasma refleja el cambio de concentración en los tejidos. Este modelo establece que la velocidad de eliminación de un compuesto, en un momento dado, sólo es proporcional a su concentración. La variable eliminación incluye la expulsión del compuesto por todas las rutas de excreción y la desaparición por biotransformación. La cinética de primer orden se representa matemáticamente de la siguiente manera:
dC/dt = - k (^) elC
donde C = concentración plasmática k (^) el = constante de velocidad de eliminación de
primer orden
