Búsqueda y Caracterización de Gene y Sus Productos: Un Trabajo Práctico de Bioinformática | Esquemas y mapas conceptuales de Bioinformática

Trabajo Práctico de Bioinformática

La búsqueda y caracterización de genes y sus productos en bases de datos es una herramienta fundamental de

la Biología Molecular y sus aplicaciones. Existen multitud de bases de datos y programas en internet que

permiten identificar genes a partir de una secuencia de ADN o bien encontrar secuencias de ADN de genes de

interés. Una vez halladas estas secuencias, puede estudiarse la estructura génica, el transcripto producido y el

producto final, ya sea éste un polipéptido o un ARN. En este trabajo práctico practicaremos estos aspectos desde

los dos puntos de partida mencionados anteriormente.

1) Cómo identificar y caracterizar un gen a partir de su secuencia de ADN

Entre las sustancias que permiten a las plantas resistir enfermedades se encuentran los fenilpropanoides. Estas

sustancias, entre las que se encuentran el ácido cinámico, el ácido cumárico, la cumarina y el cinamaldehído, se

sintetizan a partir de ciertos aminoácidos, como la fenilalanina. En un estudio de plantas de maíz sensibles a

ciertas enfermedades se encontró que algunas eran incapaces de sintetizar ácido cumárico. Mediante estudios

de biología molecular se encontró que poseían un defecto en una secuencia de ADN, que en las plantas

resistentes era la siguiente:

1 GCACCATCCA GTGCATCACG AGCTCTTCTG CACCAGATTA GCAGGCCATC GCCTACTTTT

61 GGCTTCCAAA TCATTTATTT ACGGCGTACG TGCCTTCTGT TCAAACCCCA GCCCCGCTGC

121 AATGGAGTGC GACAACGGCC GCGTCGCTGC TACCAACGGC GACTCCCTGT GCATGGCGCT

181 GCCCCGCGCC GCCGACCCGC TTAACTGGGG GAAGGCGGCG GAGGAGATGA TGGGCAGCCA

241 CCTCGACGAG GTGAAGCGGA TGGTGGCCGA GTACCGCCAG CCCCTGGTGA AGATCGAGGG

301 CGCCAGCCTC CGCATCGCGC AGGTGGCCGC TGTCGCCGCC GGCGCGGGCG AGGCCCGGGT

361 CGAGCTCGAC GAGTCCGCCC GCGGCCGGGT CAAGGCGAGC AGCGACTGGG TCAGGGACAG

421 CATGATGAAC GGCACCGACA GCTACGGCGT CACCACCGGC TTCGGCGCCA CCTCCCACCG

481 CCGCACCAAG GAGGGCGGCG CTCTCCAGAG GGAGCTCATC AGGTTCCTCA ACGCCGGCGC

541 CTTTGGCATC GGCACCGACG CCGGCCACGT CCTGCCGGCC GAGGCCACGC GCGCGGCCAT

601 GCTCGTCCGC ATCAACACCC TCCTCCAGGG CTACTCCGGT ATCCGCTTCG AGATCCTCGA

661 GGCCATCGTC AAGCTGCTCA ATGCCAACGT CACGCCGTGC CTGCCGCTGC GCGGCACGGT

721 CACCGCGTCC GGCGACCTCG TGCCGCTCTC CTACATTGCT GGCCTCGTCA CCGGGCGCGA

781 GAACGCCGTT GCGGTGGCTC CCGATGGCAC CAAGGTGAAC GCCGCGGAGG CGTTCAGGAT

841 CGCCGACATC CAAAGCGGCT TCTTCGAGCT GCAGCCCAAG GAAGGTCTCG CCATGGTGAA

901 CGGCACTGCC GTGGGCTCCG GCCTTGCCTC CACGGTGCTC TTTGAGGCGA ACGTACTTGC

961 CGTCCTTGCC GAGGTCCTGT CCGCCGTGTT CTGCGAGGTC ATGAACGGCA AGCCGGAGTA

1021 CACCGACCAC CTGACCCACA AGCTGAAGCA CCACCCAGGA CAGATCGAGG CGGCTGCCAT

1081 CATGGAGCAC ATCTTGGAAG GCAGTTCCTA CATGAAGCTT GCTAAGAAGC TCGGTGAGCT

1141 CGACCCGTTG ATGAAGCCCA AGCAGGACAG GTACGCGCTC CGTACGTCGC CGCAGTGGCT

1201 CGGCCCGCAG ATTGAGGTTA TCCGTGCCTC CACCAAGTCC ATTGAGCGCG AGATCAACTC

1261 CGTCAACGAC AACCCGCTCA TCGACGTCGC CCGAAGCAAG GCCCTTCACG GTGGCAACTT

1321 CCAGGGCACG CCCATCGGGG TGTCCATGGA CAACACCCGT CTCGCCGTCG CAGCCATCGG

1381 CAAGCTCATG TTTGCGCAGT TCTCTGAGCT CGTCAACGAC TACTACAACA ACGGCTTGCC

1441 CTCCAACCTG TCCGGCGGGC GCAACCCCAG CTTGGACTAC GGCTTCAAGG GCGCCGAGAT

1501 CGCCATGGCG TCCTACTGCT CTGAGCTGCA GTTCCTGGGG AACCCGGTCA CCAACCACGT

1561 CCAGAGCGCG GAGCAGCACA ACCAGGACGT GAACTCGCTC GGACTCATCT CCTCCAGGAA

1621 GACTGCTGAG GCCATCGAGA TCCTCAAGCT CATGTCCTCC ACGTTCCTGA TCGCCCTGTG

1681 CCAGGCGGTG GACCTGCGCC ACATCGAGGA GAACGTCAAG AGCGCCGTCA AGAGCTGCGT

1741 GATGACGGTG GCCAAGAAGA CTCTGAGCAC CAACTCCACC GGTGGCCTCC ACGTCGCCCG

1801 CTTCTGCGAG AAGGACCTGC TCCAGGAGAT CGAGCGCGAG GCGGTGTTCG CGTATGCTGA

1861 CGACCCCTGC AGCGCTAACT ACCCGCTGAT GAAGAAGCTT CGCAACGTGC TCGTGGAGCG

1921 CGCCCTCGCC AATGGCACCG CCGAGTTCGA CGCCGAGACA TCCGTGTTCG CTAAGGTCGC

1981 CCAGTTCGAG GAGGAGCTGC GCACGGCGCT GCCCAGTGCG GTGGAGGCTG CACGGGCGGC

2041 TGTCGAAAAC GGCACGGCAG CGATACCGAA CAGAATCGCC GAGTGCCGCT CCTACCCGCT

2101 CTACCGCTTC GTGCGCGAGG AGCTCGGAGC AGTGTACCTC ACCGGCGAGA AGACGCGCTC

2161 TCCCGGCGAG GAGCTTAACA AGGTGCTCGT TGCCATCAAC CAGGGCAAGC ACATCGACCC

2221 GCTGCTCGAG TGCCTCAAGG AGTGGAACGG CGAGCCCCTG CCCATCTGCT GAACAGAGAA

2281 AATACAAGGA GCAGAAGACT GTATTTTTTA GCTAATACGC ACTTTTTATT CCTAATTTAT

2341 TTATGTTCGT AAGTTCGTTG ATATGCTACG CAATCTTGTT ATTCAGCTGC AACGCCAACC

2401 TGCTTTGCTT TGAGCAAGGT CTGGTGAGTG ATTGAAAAAA ATGTTGTTGC AAGCTGTACC

2461 TTGTATGTTT TTCAACAGGT GAATCTCACG TTTGATGCAT TGGATCAGAC

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La búsqueda y caracterización de genes y sus productos en bases de datos es una herramienta fundamental de la Biología Molecular y sus aplicaciones. Existen multitud de bases de datos y programas en internet que permiten identificar genes a partir de una secuencia de ADN o bien encontrar secuencias de ADN de genes de interés. Una vez halladas estas secuencias, puede estudiarse la estructura génica, el transcripto producido y el producto final, ya sea éste un polipéptido o un ARN. En este trabajo práctico practicaremos estos aspectos desde los dos puntos de partida mencionados anteriormente. 1) Cómo identificar y caracterizar un gen a partir de su secuencia de ADN Entre las sustancias que permiten a las plantas resistir enfermedades se encuentran los fenilpropanoides. Estas sustancias, entre las que se encuentran el ácido cinámico, el ácido cumárico, la cumarina y el cinamaldehído, se sintetizan a partir de ciertos aminoácidos, como la fenilalanina. En un estudio de plantas de maíz sensibles a ciertas enfermedades se encontró que algunas eran incapaces de sintetizar ácido cumárico. Mediante estudios de biología molecular se encontró que poseían un defecto en una secuencia de ADN, que en las plantas resistentes era la siguiente: 1 GCACCATCCA GTGCATCACG AGCTCTTCTG CACCAGATTA GCAGGCCATC GCCTACTTTT 61 GGCTTCCAAA TCATTTATTT ACGGCGTACG TGCCTTCTGT TCAAACCCCA GCCCCGCTGC 121 AATGGAGTGC GACAACGGCC GCGTCGCTGC TACCAACGGC GACTCCCTGT GCATGGCGCT 181 GCCCCGCGCC GCCGACCCGC TTAACTGGGG GAAGGCGGCG GAGGAGATGA TGGGCAGCCA 241 CCTCGACGAG GTGAAGCGGA TGGTGGCCGA GTACCGCCAG CCCCTGGTGA AGATCGAGGG 301 CGCCAGCCTC CGCATCGCGC AGGTGGCCGC TGTCGCCGCC GGCGCGGGCG AGGCCCGGGT 361 CGAGCTCGAC GAGTCCGCCC GCGGCCGGGT CAAGGCGAGC AGCGACTGGG TCAGGGACAG 421 CATGATGAAC GGCACCGACA GCTACGGCGT CACCACCGGC TTCGGCGCCA CCTCCCACCG 481 CCGCACCAAG GAGGGCGGCG CTCTCCAGAG GGAGCTCATC AGGTTCCTCA ACGCCGGCGC 541 CTTTGGCATC GGCACCGACG CCGGCCACGT CCTGCCGGCC GAGGCCACGC GCGCGGCCAT 601 GCTCGTCCGC ATCAACACCC TCCTCCAGGG CTACTCCGGT ATCCGCTTCG AGATCCTCGA 661 GGCCATCGTC AAGCTGCTCA ATGCCAACGT CACGCCGTGC CTGCCGCTGC GCGGCACGGT 721 CACCGCGTCC GGCGACCTCG TGCCGCTCTC CTACATTGCT GGCCTCGTCA CCGGGCGCGA 781 GAACGCCGTT GCGGTGGCTC CCGATGGCAC CAAGGTGAAC GCCGCGGAGG CGTTCAGGAT 841 CGCCGACATC CAAAGCGGCT TCTTCGAGCT GCAGCCCAAG GAAGGTCTCG CCATGGTGAA 901 CGGCACTGCC GTGGGCTCCG GCCTTGCCTC CACGGTGCTC TTTGAGGCGA ACGTACTTGC 961 CGTCCTTGCC GAGGTCCTGT CCGCCGTGTT CTGCGAGGTC ATGAACGGCA AGCCGGAGTA 1021 CACCGACCAC CTGACCCACA AGCTGAAGCA CCACCCAGGA CAGATCGAGG CGGCTGCCAT 1081 CATGGAGCAC ATCTTGGAAG GCAGTTCCTA CATGAAGCTT GCTAAGAAGC TCGGTGAGCT 1141 CGACCCGTTG ATGAAGCCCA AGCAGGACAG GTACGCGCTC CGTACGTCGC CGCAGTGGCT 1201 CGGCCCGCAG ATTGAGGTTA TCCGTGCCTC CACCAAGTCC ATTGAGCGCG AGATCAACTC 1261 CGTCAACGAC AACCCGCTCA TCGACGTCGC CCGAAGCAAG GCCCTTCACG GTGGCAACTT 1321 CCAGGGCACG CCCATCGGGG TGTCCATGGA CAACACCCGT CTCGCCGTCG CAGCCATCGG 1381 CAAGCTCATG TTTGCGCAGT TCTCTGAGCT CGTCAACGAC TACTACAACA ACGGCTTGCC 1441 CTCCAACCTG TCCGGCGGGC GCAACCCCAG CTTGGACTAC GGCTTCAAGG GCGCCGAGAT 1501 CGCCATGGCG TCCTACTGCT CTGAGCTGCA GTTCCTGGGG AACCCGGTCA CCAACCACGT 1561 CCAGAGCGCG GAGCAGCACA ACCAGGACGT GAACTCGCTC GGACTCATCT CCTCCAGGAA 1621 GACTGCTGAG GCCATCGAGA TCCTCAAGCT CATGTCCTCC ACGTTCCTGA TCGCCCTGTG 1681 CCAGGCGGTG GACCTGCGCC ACATCGAGGA GAACGTCAAG AGCGCCGTCA AGAGCTGCGT 1741 GATGACGGTG GCCAAGAAGA CTCTGAGCAC CAACTCCACC GGTGGCCTCC ACGTCGCCCG 1801 CTTCTGCGAG AAGGACCTGC TCCAGGAGAT CGAGCGCGAG GCGGTGTTCG CGTATGCTGA 1861 CGACCCCTGC AGCGCTAACT ACCCGCTGAT GAAGAAGCTT CGCAACGTGC TCGTGGAGCG 1921 CGCCCTCGCC AATGGCACCG CCGAGTTCGA CGCCGAGACA TCCGTGTTCG CTAAGGTCGC 1981 CCAGTTCGAG GAGGAGCTGC GCACGGCGCT GCCCAGTGCG GTGGAGGCTG CACGGGCGGC 2041 TGTCGAAAAC GGCACGGCAG CGATACCGAA CAGAATCGCC GAGTGCCGCT CCTACCCGCT 2101 CTACCGCTTC GTGCGCGAGG AGCTCGGAGC AGTGTACCTC ACCGGCGAGA AGACGCGCTC 2161 TCCCGGCGAG GAGCTTAACA AGGTGCTCGT TGCCATCAAC CAGGGCAAGC ACATCGACCC 2221 GCTGCTCGAG TGCCTCAAGG AGTGGAACGG CGAGCCCCTG CCCATCTGCT GAACAGAGAA 2281 AATACAAGGA GCAGAAGACT GTATTTTTTA GCTAATACGC ACTTTTTATT CCTAATTTAT 2341 TTATGTTCGT AAGTTCGTTG ATATGCTACG CAATCTTGTT ATTCAGCTGC AACGCCAACC 2401 TGCTTTGCTT TGAGCAAGGT CTGGTGAGTG ATTGAAAAAA ATGTTGTTGC AAGCTGTACC 2461 TTGTATGTTT TTCAACAGGT GAATCTCACG TTTGATGCAT TGGATCAGAC

Copiá esta secuencia (así como está, con números y todo) e introducila en el programa BLAST, que se encuentra en: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. BLAST es una herramienta para realizar alineamientos de secuencia y así identificar una secuencia desconocida. Su nombre significa “Herramienta Básica para la Búsqueda de Alineamientos Locales”, en inglés: “Basic Local Alignment Search Tool”. Al entrar, vas a ver esta pantalla: Las distintas opciones te permiten investigar una secuencia de ADN (Nucleotide BLAST, a la izquierda), de proteína (Protein BLAST, a la derecha) o traducir una en otra (opciones del centro). En nuestro caso, vamos entrar en Nucleotide Blast y vamos a pegar la secuencia de ADN en la ventana que dice “Enter Query Sequence” INSERTA LA SECUENCIA DE ADN AQUI

Una vez que hayas insertado el número de locus, apretá “search” (a la derecha) y fijate que te va a dar las proteínas con ese nombre que haya en su base de datos. En este punto es importante aclarar que estas bases de datos son redundantes, es decir que contienen todo lo que los investigadores hayan incorporado allí, de modo que si dos o más investigadores estaban trabajando con el mismo gen, puede haber más de una entrada para el mismo gen o proteína. En nuestro caso, andá a la primera que aparece, clickeá en ella y fijate lo que encontrás. Uniprot, como lo sugiere su nombre, reúne información de varias plataformas diferentes, las cuales están como links en la página que se te va a abrir. Estaría bueno hacer una exploración a través de estos recursos. Por ejemplo, donde dice “GO-…” se refiere a “Gene Ontology”, que es algo así como una clasificación de los genes de acuerdo a su función. Fijate en las funciones que pone para este gen tanto en la función molecular como en el proceso biológico. Más abajo vas a encontrar los nombres y taxonomía tanto para la proteína como para la especie vegetal de donde proviene. Con respecto a la taxonomía de la proteína, es importante recalcar una clasificación que aparece como “EC: …” donde los … son unos números separados por puntos, por ejemplo: 1.1.1.1. Ese nombre corresponde a una clasificación de las enzimas de acuerdo a la reacción que catalizan, realizada por la Enzyme Commision (de donde viene la abreviatura EC; para una descripción, podés ver https://es.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAmero_EC y links allí adentro). Continuando con las descripciones, vas a encontrar más abajo otra que te da la ubicación subcelular, y a continuación otra que se llama “Interaction” y que si entrás allí te va a dar un mapa de todas las otras proteínas que interactúan con la que encontraste. Esto es muy útil para intentar armarse una idea de en qué procesos puede intervenir esta proteína. Por su parte, en “Family and Domains” vas a encontrar una cantidad de plataformas que explican la estructura de la proteína y la distribución de sus dominios funcionales. Entrá en esos links a ver qué podés descubrir. Finalmente, vamos a explorar otro programa, llamado KEGG Pathway, que está en https://www.genome.jp/kegg/pathway.html y que te va a permitir estudiar la vía metabólica donde actúa la proteína que acabás de descubrir. Allí tenés que seleccionar el organismo (en nuestro caso, zma, por Zea mays , pero si no sabés la sigla la encontrás apretando donde dice “Organism”) y luego en la ventana donde dice “Enter keywords”, es decir, “Ingresar palabras-clave”, ingresá el nombre de la enzima con el número EC que tenés que copiar desde Uniprot.

Una vez que ingreses, te va a mostrar unos mapas metabólicos en miniatura. Seleccioná el más relevante de acuerdo a lo que queremos saber de este gen (para eso releé el párrafo introductorio, donde te dice por qué estamos estudiando esta secuencia de ADN). Una vez que entres a la vía metabólica vas a ver algo como esto: donde tu proteína de interés está remarcada en rojo (tené en cuenta que este NO ES el mapa de la proteína que estamos estudiando, es solo a título de ejemplo). En el mapa, todas las enzimas están indicadas con sus números EC y los recuadros verdes indican que esa proteína se encuentra en el genoma del organismo que se seleccionó para estudiar. Los rectángulos blancos, en cambio, indican que esas enzimas se conocen pero no se pudieron localizar en el genoma de la especie que se seleccionó para estudiar. Las flechas indican el sentido preferencial de las reacciones (recordá que todas son reversibles) y los circulitos con un nombre al lado indican los metabolitos. Si clickeás en un círculo te muestra la fórmula química de cada metabolito, y si clickeás en una enzima va a otras páginas donde te da características de las enzimas y de las reacciones catalizadas. Una vez que hayas encontrado la vía metabólica donde interviene nuestra proteína (recordá que puede haber más de una vía metabólica donde interviene la misma proteína y tenés que elegir la más relevante para nuestros objetivos) explorala y responde por qué la planta sensible a la enfermedad que originó este estudio era incapaz de sintetizar ácido cumárico, y qué otras sustancias relacionadas con la resistencia a enfermedades podrían estar ausentes en este tipo de plantas. 1) Cómo encontrar secuencias de ADN de genes de interés Supongamos que en vez de contar con una secuencia de ADN tenemos la sospecha de que cierta función biológica puede ser interesante con el objeto de entender y mejorar la resistencia a enfermedades. Entre estas, podemos mencionar una serie de proteínas llamadas “proteínas relacionadas con patogénesis” o “pathogenesis- related proteins”, las cuales se abrevian como PR seguidas de un número, por ejemplo PR-1. Otras proteínas de interés son las quitinasas (chitinases en inglés) que son enzimas capaces de digerir las paredes celulares de los hongos. Para encontrar sus secuencias de ADN y proteínas, vamos a ir nuevamente a la plataforma de los Institutos Nacionales de Salud de EEUU (National Institutes of Health, NIH) donde estaba la plataforma BLAST, y vamos a entrar a un sitio diferente, llamado Gene: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/

La barra azul representa el ARNm y la roja, la proteína. ¿Por qué la barra roja es más corta que la azul? Si te parás con el cursor encima de las barras, te va a mostrar la secuencia de proteína o nucleótidos correspondiente a la zona donde te paraste. Además, si movés las barras verticales y apretás la lupa que está encima, podés ver la secuencia de ADN correspondiente a la zona entre esas barras. Si seguís hacia abajo, vas a encontrar enlaces a la secuencia del ARNm y a la proteína: ARNm (^) Proteína

Entrá en ambos, y fijate que en la proteína, además de los atributos que se encuentran en “FEATURES” vas a encontrar uno que se llama “sig_peptide”, que significa “péptido señal”. Si apretás ahí, te va a señalar los aminoácidos que forman ese péptido señal. Buscá en la literatura y en internet qué es y para qué sirve el péptido señal, y en relación con eso, deducí por qué a esta proteína la nombran como “precursor”. Luego de esto, entrá nuevamente a Uniprot con el locus correspondiente a esta proteína y fíjate si en la ubicación subcelular encontrás la explicación de para qué sirve el péptido señal. Finalmente, repetí el ejercicio con la quitinasa de tomate (entrá al mismo sitio Gene con “chitinase tomato”) y fíjate que en la barra verde que vimos antes podés encontrar la estructura de exones e intrones de ese gen. Buscá qué representan estas estructuras y cómo se procesan durante la maduración del ARNm. Además de estos ejercicios, aprovechá para navegar por todos estos sitios y los relacionados por los links que encuentres en ellos, y tomate el tiempo para averiguar qué son todos los recursos que hay y para qué sirven. La mejor manera de aprender estas cosas es metiendo la mano.

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