Práctica: Actividad enzimática

Fecha de entrega: 2

Se determinó la actividad enzimática de 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, una enzima de vital

importancia en la industria alimentaria y de la salud, pues juega un papel fundamental en la

hidrólisis de enlaces glicosídicos. En el área de la salud genera metabolitos secundarios como

los flavonoides que poseen propiedades antioxidantes con efectos positivos en el organismo,

entre otras. La determinación se llevó a cabo mediante un ensayo colorimétrico, el cual nos

permitió determinar las condiciones óptimas a partir de las variaciones de pH y temperatura.

El ensayo se llevó a cabo en el laboratorio virtual para detectar dicha enzima con DNS y

posteriormente los datos de absorbancias obtenidas fueron registrados para un análisis.

Palabras clave: enzima, 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, condiciones óptimas, pH,

temperatura, DNS, absorbancia.

Introducción

Las enzimas son moléculas orgánicas que

actúan como catalizadores de reacciones

químicas , es decir, aceleran la velocidad de

reacción. Comúnmente son de naturaleza

proteica, pero también de ARN. Los enzimas

son catalizadores, es decir, sustancias que,

sin consumirse en una reacción, aumentan

notablemente su velocidad; no hacen

factibles las reacciones imposibles, sino que

solamente aceleran las que

espontáneamente podrían producirse. Cada

enzima cataliza un solo tipo de reacción, y

casi siempre actúa sobre un único sustrato o

sobre un grupo muy reducido de ellos. La

cinética enzimática estudia la velocidad de

las reacciones químicas que son catalizadas

por las enzimas (Michaelis Menten, 1913) su

objetivo principal es determinar el

mecanismo químico que subyace en la

reacción enzimática, es decir, determinar la

secuencia ordenada de sucesos que

transcurren en la transformación de sustrato

en producto. Así la cinética enzimática esta

relacionada con la a velocidad de reacción

de los intermediarios enzimáticos formados.

La Km nos da una idea la afinidad que tiene

el enzima por su sustrato, cuanto mayor es

Km menor es la afinidad (predominan las

formas E y S libres), cuanto menor es Km

mayor es la afinidad (predomina la forma

ES). La velocidad máxima Vmáx estima el

número de centros activos del enzima.

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Práctica: Actividad enzimática Fecha de entrega: 2 Se determinó la actividad enzimática de 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, una enzima de vital importancia en la industria alimentaria y de la salud, pues juega un papel fundamental en la hidrólisis de enlaces glicosídicos. En el área de la salud genera metabolitos secundarios como los flavonoides que poseen propiedades antioxidantes con efectos positivos en el organismo, entre otras. La determinación se llevó a cabo mediante un ensayo colorimétrico, el cual nos permitió determinar las condiciones óptimas a partir de las variaciones de pH y temperatura. El ensayo se llevó a cabo en el laboratorio virtual para detectar dicha enzima con DNS y posteriormente los datos de absorbancias obtenidas fueron registrados para un análisis. Palabras clave: enzima, 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, condiciones óptimas, pH, temperatura, DNS, absorbancia. Introducción Las enzimas son moléculas orgánicas que actúan como catalizadores de reacciones químicas , es decir, aceleran la velocidad de reacción. Comúnmente son de naturaleza proteica, pero también de ARN. Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad; no hacen factibles las reacciones imposibles, sino que s o l a m e n t e a c e l e r a n l a s q u e espontáneamente podrían producirse. Cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas (Michaelis Menten, 1913) su objetivo principal es determinar el mecanismo químico que subyace en la reacción enzimática, es decir, determinar la secuencia ordenada de sucesos que transcurren en la transformación de sustrato en producto. Así la cinética enzimática esta relacionada con la a velocidad de reacción de los intermediarios enzimáticos formados. La Km nos da una idea la afinidad que tiene el enzima por su sustrato, cuanto mayor es Km menor es la afinidad (predominan las formas E y S libres), cuanto menor es Km mayor es la afinidad (predomina la forma ES). La velocidad máxima Vmáx estima el número de centros activos del enzima.

Figura 1. Enzimas Es así que las enzimas suelen ser activas en determinado rango de condiciones de con un óptimas donde su velocidad de reacción es máxima. Asi mismo existen parámetros que se pueden modificar en las recciones enzimáticas para alterar la cinética de una enzima como lo son pH, temperatura, concentraciones salinas, inhibidores enzimaticos, cofactores, entre otros. La mayoría de las enzimas del cuerpo humano funcionan bien a 36-37 °C, que es la temperatura corporal. Para la enzima 6-O-α- L-ramnosil-D-glucosidasa, sus condiciones óptimas son pH y temperatura óptima de 6. y 55ºC. La importancia de las enzimas se pone de manifiesto en el hecho de que una enfermedad letal puede ser causada por el mal funcionamiento de un único tipo de enzima de todos los miles de tipos que existen en nuestro cuerpo. Si consideramos que la resorción de rutinósidos ocurre sólo en el intestino delgado por la acción de la microflora intestinal humana que produce principalmente α-L-ramnosidasas y D- glucosidasas; los glicoconjugados que contienen rutinosa son resistentes a la hidrólisis en los tejidos humanos debido a la ausencia de α-L-ramnosidasas en mamíferos (Knaup et al., 2007). Por lo tanto, la síntesis de rutinósidos puede ser pensada como una forma de direccionamiento de drogas en una terapia inyectable. Los enzimas, a diferencia de los catalizadores inorgánicos catalizan reacciones específicas. Sin embargo hay distintos grados de especificidad. La enzima 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosidasa, hidroliza el enlace glucosídico de un sustrato que añadimos, la hesperidina, un glicósido natural formado por la unión de rutinosa con hesperetina. La rutinosa que se libera es el

disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosa y

tiene carácter reductor (en el C1 de la glucosa). Figura 2. Hesperidina y productos Se aplica entonces un ensayo para detectar azúcares reductores (en este caso, la rutinosa), consistente en su reacción con el dinitrosalicilato (DNS) que es un compuesto aromático que reacciona con los azúcares reductores y otras moléculas reductoras. El DNS, de color amarillo en medio básico, se reduce a 3-amino-5-nitrosalicilato, de color rojo ladrillo: (el aldehído del azúcar reductor se oxida a ácido) Se mide el color rojo del producto a 540 nm. Figura 2.1 DNS Planteamiento del problema Saber reconocer cómo se ve modificada la actividad enzimática al modificar el pH y la temperatura de reacción

se debe observar una colorimetria, pues el DNS, de color amarillo en medio básico, se reduce a 3-amino-5-nitrosalicilato, de color rojo ladrillo en. Asi pudiendo observar que en dicho caso el pH óptimo es de 9.0. Los establecidos para la enzima 6-O-α-L- ramnosil-D-glucosidasa, sus condiciones óptimas son pH y temperatura óptima de 6. y 55ºC. y aquí, se baja la temperatura de 45 ºC entonces el pH es mayor siendo 9. Para conocer que temperatura es correcta, se toma el pH óptimo anterior, en este caso 9.0 con una absorbancia de 0.269, siendo la mas alta en la escala; y estableciendo un rango de temperaturas de 30ºC-80-Cº. Como ya mencionado, se dice que en algunos casos se busca la saturación para una mayor actividad enzimatica, La saturación ocurre porque, cuando la concentración de sustrato aumenta, disminuye la concentración de enzima libre, que se convierte en la forma con sustrato unido (ES). A la máxima velocidad (Vmax) de la enzima, todos los sitios activos de dicha enzima tienen sustrato unido, y la cantidad de complejos. Se observa en dicha tabla (2) que la aborbancia mayor es de 2. correspondiente a 70 ºC. Siendo esta la temperatura óptima en nuestro caso. Para poder determinar la velocidad máxima e una reacción enzimática, la concentración de sustrato, ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante, de formación de producto. Esa es la velocidad máxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima están saturados con sustrato. Entonces en la tabla 1 la velocidad máxima se estableció que es de 0.296, pues esta es la concentración de sustrato en 9.0 pH y con una temperatura de 45ºC. Y en la tabla 2 la concentración de sustrato es de 2.286, siendo esta la velocidad máxima para temperatura de 70ºC y 9.0 de pH La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante pór múltiples razones: KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Utilizando la formula Km= Vmax/2 para la tabla numero 1 es de 0.148 mM y para la tabla numero 2 es de 1.143 mM Conclusiones Una vez terminada la práctica se puede concluir qué: Las enzimas como cualquier catalizador incrementan notablemente la velocidad de las reacciones químicas al disminuir su energía de activación sin ser modificadas o consumidas en la reacción. La gran mayoría de las reacciones en los seres vivos necesitan ser catalizadas para que ocurran a una velocidad apreciable porque así la célula puede regular en forma diferencial su velocidad, regulando la actividad de los catalizadores de cada una de ellas. Para la enzima 6-O-α-L-ramnosil-D- glucosidasa, las condiciones óptimas en

dicha práctica son de 9.0 para pH y 70ºC para temperatura. La velocidad máxima es la velocidad que se obtuvo cuando todo el enzima se encuentra unido al sustrato. Siendo la formación de producto de .296 mM/seg y la concentración se sustrato (Km) de 0.148 mM Para la tabla 2 la velocidad máxima para concentración de producto es de 2.286 mM/seg y la concentración de sustrato (Km) de 1.143 mM. Para los seres humanos, en casi de sufrir una ausencia de α-L-ramnosidasas en los tejidos, se utilizaría la síntesis de rutinósidos que son obtenidos en la hesperidina, pues la rutinosa que se libera

es el disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-

glucosa y esta puede ser pensada como una forma de direccionamiento de drogas en una terapia inyectable. Referencias

Neher BD, Mazzaferro L S, Kotik M, Oyhenart J, Halada P, Kren V, Breccia JD. (2016). Bacteria as source of diglycosidase activity: Actinoplanes missouriensis p r o d u c e s 6 - O -α- L - r h a m n o s y l - - D - glucosidase active on flavonoids. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100, 3061–3070.
Ramírez, J., Ayala, M., & UNAM.(2014). E N Z I M A S : ¿ Q U É S O N Y C Ó M O FUNCIONAN? Revista digital universitaria , 15(12), 4-11. Recuperado de http:// www.revista.unam.mx/vol.15/num12/art91/ art91.pdf - Rivera, E., & UNAM. (s. f.). Cinética Enzimática. de http://depa.fquim.unam.mx/ amyd/archivero/CineticaEnzimatica- EnriqueRivera_32548.pdf

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disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-glucosa y

es el disacárido 6-O-α-L-ramnosil-D-