Understanding RT-PCR: A Technique for Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction, Summaries of Law of Torts

Download Understanding RT-PCR: A Technique for Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction and more Summaries Law of Torts in PDF only on Docsity!

Kỹ thuật RT-PCR

 - LỚP 20YA1 – NHÓM - TIỂU NHÓM - Nguyễn Bảo Ngọc-20YA 

• Lê Đoàn Trung Hiếu-20YA
• Phạm Lại Hoàng Hão-20YA

Sơ lược về RT-PCR.

Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (RT-PCR) ( Reverse transcription polymerase chain reaction ) là một kỹ thuật trong phòng thí nghiệm. RT-PCR được sử dụng để phiên mã ngược RNA thành cDNA và sau đó khuếch đại kết quả này bằng cách sử dụng PCR.

• Kỹ thuật này thường được sử dụng trong sinh học phân tử để phát hiện biểu hiện RNA RT-PCR thường bị nhầm lẫn với phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (qPCR). Tuy nhiên, chúng là những kỹ thuật riêng biệt và khác biệt.

RT-PCR một bước

Tất cả các thành phần phản ứng được trộn trong một ống nghiệm trước khi bắt đầu phản ứng. Mặc dù RT-PCR một bước mang lại sự đơn giản và tiện lợi và giảm thiểu khả năng nhiễm bẩn nhưng cDNA thu được không thể được sử dụng để phát hiện nhiều thông điệp từ một mẫu RNA đơn lẻ như trong RT-PCR hai bước. Tất cả các thành phần phản ứng được trộn trong một ống nghiệm trước khi bắt đầu phản ứng. Mặc dù RT-PCR một bước mang lại sự đơn giản và tiện lợi và giảm thiểu khả năng nhiễm bẩn nhưng cDNA thu được không thể được sử dụng để phát hiện nhiều thông điệp từ một mẫu RNA đơn lẻ như trong RT-PCR hai bước.

RT-PCR hai bước

RT-PCR bao gồm hai bước: phản ứng RT và khuếch đại PCR, có thể là PCR đơn giản hoặc qPCR.

• Đầu tiên , RNA được phiên mã ngược thành DNA bổ sung (cDNA) bằng cách sử dụng enzym phiên mã ngược. • CDNA thu được được sử dụng làm khuôn mẫu cho quá trình khuếch đại PCR tiếp theo bằng cách sử dụng các đoạn mồi đặc trưng cho một hoặc nhiều gen.

Quy trình thực hiện

**- RT-PCR có thể được thực hiện bởi:

• RT-PCR một bước
• RT-PCR hai bước
• Lưu ý: Chỉ sử dụng RNA chất lượng cao, nguyên vẹn để có kết quả tốt nhất. Đảm bảo sử dụng đoạn mồi dành riêng cho từng trình tự.**

RT-PCR một bước

RT-PCR một bước lấy các mục tiêu mRNA (lên đến 6 kb) và khiến chúng phải phiên mã ngược và sau đó khuếch đại PCR trong một ống nghiệm duy nhất. Lấy tất cả các vật liệu, thiết bị và dụng cụ cần thiết (bộ dụng cụ phải bao gồm danh sách chi tiết các vật dụng cần thiết). Chọn một kit RT-PCR một bước, phải bao gồm hỗn hợp với men sao chép ngược và hệ thống PCR như Taq DNA Polymerase và polymerase hiệu đính Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, bao gồm dNTPs, mồi, RNA khuôn, các enzym cần thiết và dung dịch đệm.

RT-PCR hai bước

Bước một

• Kết hợp RNA khuôn mẫu, mồi, hỗn hợp dNTP và nước không chứa nuclease trong một ống PCR.
• Thêm chất ức chế RNase và men sao chép ngược vào ống PCR.
• Đặt ống PCR vào máy tuần hoàn nhiệt trong một chu kỳ bao gồm ủ, kéo dài và sau đó khử hoạt tính men sao chép ngược.
• Tiến hành PCR trực tiếp hoặc bảo quản trên đá lạnh cho đến khi thực hiện được PCR.

RT-PCR hai bước

Bước hai Thêm hỗn hợp chính (chứa đệm, hỗn hợp dNTP, MgCl2, Taq polymerase và nước không chứa nuclease) vào mỗi ống PCR. (Nếu q-PCR được thực hiện để khuếch đại, hãy sử dụng kết hợp tổng thể qPCR). Thêm đoạn mồi thích hợp. Đặt các ống PCR vào chu kỳ nhiệt trong 30 chu kỳ của chương trình khuếch đại, bao gồm ba bước: (1) biến tính, (2) ủ, (3) kéo dài. Các sản phẩm RT-PCR sau đó có thể được phân tích bằng điện di trên gel.

Chèn gen

• RT-PCR rất hữu ích trong việc đưa các gen của sinh vật nhân thực vào sinh vật nhân sơ.
• RT-PCR thường được sử dụng để nghiên cứu bộ gen của virus có bộ gen được cấu tạo từ ARN, chẳng hạn như:

1. Virus cúm.
2. Retrovirus như HIV.
3. Virus corana(Covid-19)

Các ứng dụng của RT-PCR

Đưa các gen của sinh vật nhân thực vào sinh vật nhân sơ. Virus HIV

Các ứng dụng của RT-PCR

Chuẩn đoán covid- Thu thập mẫu bệnh phẩm( dịch tỵ hầu) ở vùng mũi họng bằng tăm bông vô trùng

Các ứng dụng của RT-PCR

Chuẩn đoán covid- Sau đó, RNA được chuyển đổi thành DNA bằng quá trình được gọi là phiên mã ngược Enzyme phiên mã ngược được sử dụng trong quá trình.

Các ứng dụng của RT-PCR

Chuẩn đoán covid- DNA được trộn với mồi, các phần DNA được thiết kế để liên kết với phần đặc trưng của DNA virus. Sử dụng PCR tạo ra hàng triệu bản sao DNA của virus