Download Microbiology Lab Techniques: Identification and Cultivation of Bacteria and Viruses and more Cheat Sheet Microbiology in PDF only on Docsity!
На третій день (ІІІ етап дослідження) вивчають характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію. Спочатку роблять мазок, фарбуючи його за методом Грама, з метою перевірки культури на чистоту. Якщо під мікроскопом спостерігають бактерії однотипної морфології, розмірів та тинкторіальних (здатність фарбуватись) властивостей, роблять висновок, що культура чиста.
- Визначення виду бактерій за їх морфологічними ознаками називається морфологічною ідентифікацією.
- Визначення виду збудників за їх культуральними ознаками називають культуральною ідентифікацією. Найчастіше (при вивченні бх) досліджують цукролітичні, протеолітичні властивості, утворення ферментів, перетворення нітратів у нітрити тощо. Для цього існують спеціальні живильні середовища, які засівають мікроорганізмами.
- Визначення виду збудника за його біохімічними властивостями називається біохімічною ідентифікацією.
- Для дослідження здатності бактерій розщеплювати білки використовують молоко або середовище з желатином. Протеоліз у молоці виражається розчиненням згустка казеїну, який утворено бактеріями, що згортають молоко. Оскільки деякі види бактерій відрізняються за особливостями розрідження желатину, цю ознаку можна враховувати при їх ідентифікації.
- Пептолітичні властивості (здатність розщеплювати пептони – продукти неповного гідролізу білка) виявляють за допомогою МПБ і пептонної води. Їх засівають мікроорганізмами, а потім визначають утворення кінцевих продуктів – аміаку, сірководню та індолу. (Для аміаку в пробірку вставляють червоний лакмусовий папірець - синій. На сірководень є розчин ацетату свинцю, який за забарвлює фільтрувальний папір у чорний колір за рахунок утворення сульфіду свинцю. Індол - смужкою фільтрувального паперу, змоченого 12 % розчином щавелевої кислоти. (рожевий)
- Більш чутливим є метод Ерліха. Пробкою пробірки притискають папірець, просякнутий спеціальним індикатором (спиртовий розчин парадиметиламідобензальдегіду). При наявності індолу колір його змінюється на бузково-рожевий або малиновий. В іншому варіанті визначення індолу до 48-годинної бульйонної культури бактерій додають 1- 2 мл сірчаного ефіру, а потім – реактив Еріха. У нижній частині шару ефіру за 1-2 хв з’являється яскраве малинове кільце.
- У мікробіологічній практиці широко використовуються диференційно-діагностичні середовища Ендо, Левіна, Плоскирєва, які дозволяють виявити розкладання лактози бактеріями. Вони дозволяють проводити первинну диференціацію бактерій кишкового тракту.
- Середовище Ендо складається з сухого живильного агару, 1 % лактози та індикатора фуксину, знебарвленого розчином сульфіту натрію. Свіже середовище має слабке рожеве забарвлення. При рості лактозопозитивних мікроорганізмів, тих, що розщеплюють лактозу (E. coli), їх колонії забарвлюються у темно-червоний колір з металевим блиском. Колонії лактозонегативних мікробів (сальмонели, шигели) на цьому середовищі безбарвні.
- До складу середовища Левіна також входить МПА, лактоза, однозаміщений фосфат калію, індикатори метиленовий синій, еозин. Нативне середовище має фіолетовий колір. Колонії лактозопозитивних бактерій мають темно-синє забарвлення, а лактозонегативні – рожевий відтінок.
- Сухий бактоагар Плоскирєва містить у складі агар із солями жовчних кислот, лактозу, цитрат натрію, гіпосульфіт, фосфат натрію, брильянтовий зелений, соду кальциновану, йод і нейтральний червоний. Мікроорганізми, що розщеплюють лактозу, утворюють колонії рожевого кольору, а ті, що її не ферментують – безбарвні. o Середовище Гісса (для дослідження ферментації декількох цукрів). Може мати рідку та напіврідку консистенцію. Основою рідкого середовища є 1 % пептонна вода з 0,5 % натрію хлориду, 1 % вуглеводів (глюкози, мальтози, лактози, сахарози, манніту та ін.). До нього додають індикатор Андреде (кислий фуксин в 1 н розчині NaOH). Встановлюють рН 7,2, при ньому середовище має жовтий колір. Середовища з різними вуглеводами розливають в окремі пробірки, в які встановлюють поплавок – запаяну з одного кінця скляну трубочку довжиною 3 см відкритим кінцем донизу. Стерилізують парою під тиском 0,5 атм 15 хв. Після посіву бактерій, якщо вони ферментують вуглеводи, спостерігають появу червоного забарвлення, яке свідчить про зміну рН у кислу сторону (утворення кислоти), а деколи з поплавка витісняється рідина. Тоді роблять висновок про утворення газу. Отже, можливі три варіанти при обліку результатів посіву на середовише Гісса: мікроорганізми не ферментують субстрату (негативна відповідь) або бактерії розкладають вуглеводи (позитивна відповідь) з утворенням кислоти без газу чи кислоти і газу. Враховуючи, що мікроорганізми по- різному діють на вуглеводи (розкладають або не розкладають), при кінцевому обліку результатів спостерігають пробірки із зміненим або незміненим кольором рідини. Це створює враження строкатості, а такий ряд називають строкатим рядом Гісса. Зараз у більшості випадків користуються набором сухих середовищ для визначення цукролітичних ферментів, з яких готують напіврідкі строкаті ряди. На відміну від попередньої групи, до їх складу входять індикатори ВР (суміш водного голубого з розоловою кислотою) або бромтимоловий синій чи бромкрезоловий пурпурний. При наявності газу спостерігаються бульбашки або розриви живильного середовища у товщі агару. При підкисленні середовища з індикатором ВР воно стає синім, а при підлужнюванні – червоним. У лужному середовищі вони мають відповідно інтенсивно фіолетовий та синій колір із зеленкуватим полиском.
- Випускаються також сухі середовища Рессела та цукровий агар із сечовиною Олькеницького. o Середовище Рессела є напіврідким агаром із лактозою (1 %) і глюкозою (0,1 %) та індикатором ВР. Після розливання його у пробірки їх кладуть так, щоб утворився стовпчик агару і була скошена поверхня. Мікроорганізми засівають петлею спочатку уколом у стовпчик, а потім по скошеній поверхні. Якщо бактерії ферментують лактозу і глюкозу, спостерігають зміну кольору (підкислення) всього середовища на синій. Якщо мікроби здатні метаболізувати тільки глюкозу, в цьому випадку змінює колір стовпчик середовища. За умови утворення газу спостерігають за появою його бульбашок або розривами агару. o Трицукровий агар із сечовиною Олькеницького дозволяє визначити ферментацію лактози, сахарози, глюкози, утворення сірководню та наявність у бактерій ферменту уреази. До складу середовища відповідно вводять сухий живильний агар, лактозу, сахарозу, глюкозу, комплексну сіль амоній-залізо сульфат, тіосульфат натрію, сечовину, індикатор феноловий червоний. Готове середовище має блідо-рожевий колір. При
неоднорідні за своїм хімічним складом, тому існують у багатьох варіантах. Їх можна визначити за допомогою специфічних аглютинуючих сироваток. Таке визначення виду бактерій носить назву серологічної ідентифікації. Його відносять до одного з головних методів встановлення виду виділеної культури. Найчастіше використовується орієнтовна реакція аглютинації на склі. З цією метою на предметне скельце наносять різні діагностичні сироватки (проти окремих збудників або їх антигенів), а потім у кожну краплю вносять стерильною петлею невелику кількість чистої культури. За декілька хвилин спостерігають за феноменом аглютинації. Утворення аглютинату (пластівців) свідчить про гомологічність антигенів збудника та антитіл діагностичної сироватки, що дозволяє визначити вид інфекційного агента. При наявності позитивної орієнтовної реакції аглютинації її ставлять у розгорнутому варіанті (реакція аглютинації Грубера). При деяких інфекційних захворюваннях (дифтерія) ідентифікацію проводять за токсигенними властивостями мікробів. Метод грунтується на визначенні токсигенної активності коринебактерій дифтерії за допомогою реакції преципітації. Утворення ліній преципітації між колоніями токсигенних штамів та папірцем, просоченим антитоксичною сироваткою, свідчить про позитивну реакцію. Інколи ідентифікацію бактерій проводять, заражаючи лабораторних тварин чистою культурою і спостерігаючи за тими змінами, які викликають збудники в організмі (туберкульоз, ботулізм, правець, сальмонельоз тощо). Такий метод називають ідентифікацією за біологічними властивостями. Як об’єкти – найчастіше використовують гвінейських свинок, білих мишей і щурів. Дуже важливим при виділенні мікроорганізмів є визначення їх чутливості до антибіотиків з метою вибору оптимального препарату для лікування. Найчастіше користуються методом стандартних дисків (метод дифузії в агар, диско-дифузійний метод). Для цього на поверхню спеціального щільного живильного середовища в чашках Петрізасівають культуру мікроорганізмів і накладають паперові диски, просочені різними антибіотиками. Посіви інкубують при оптимальній температурі 18-24 год і вимірюють зони затримки росту бактерій навколо дисків з антибіотиками. За розмірами цих зон визначають належність бактерій до чутливих, помірно резистентних або стійких штамів. На підставі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних, антигенних, біологічних та інших властивостей мікробів роблять остаточний висновок про ідентифікацію. Наприклад: “Виділено Escherichia coli” або “Виділений збудник належить до виду Staphylococcus epidermidis”. Виділення чистої культури анаеробних бактерій У лабораторній практиці часто доводиться працювати з анаеробними мікроорганізмами. Вони більш вибагливі до живильних середовищ, ніж аероби, частіше потребують спеціальних ростових добавок, вимагають припинення доступу кисню при їх культивуванні, тривалість росту їх довша. Тому робота з ними складніша, вимагає значної уваги бактеріологів і лаборантів. Важливим є захист матеріалу, що містить анаеробні збудники від токсичного впливу атмосферного кисню. Тому матеріал із вогнищ гнійної інфекції рекомендується забирати під час їх пункції за допомогою шприца, час між взяттям матеріалу та посівом його на живильне середовище повинен бути максимально коротким. Оскільки для культивування анаеробних бактерій використовують спеціальні живильні середовища, які не повинні містити кисню і мають низький окисновідновний потенціал (- 20 - 150 мВ), до їх складу вводять індикатори – резазурин, метиленовий синій тощо, які реагують на зміну цього потенціалу. При його зростанні відновлені безбарвні форми індикаторів змінюють свій колір: резазурин забарвлює середовище в рожевий колір, а метиленовий синій – в голубий. Такі зміни свідчать про неможливість використання середовищ
для культивування анаеробних мікробів. Сприяє зниженню окисно-відновного потенціалу введення в середовище не менше 0,05 % агару, який, збільшуючи його в’язкість, сприяє зменшенню надходження кисню. Це, в свою чергу, досягається ще й використанням свіжих (не пізніше двох годин після виготовлення) і редукованих живильних середовищ. Слід врахувати, що через особливості бродильного типу метаболізму анаеробних бактерій вони вимагають багатших на живильні компоненти і вітаміни середовищ. Найчастіше використовують серцево- мозковий й печінковий настої, соєві та дріжджові екстракти, гідролітичний перевар казеїну, пептон, триптон. Обов’язковим є додавання факторів росту, таких як твін-80, гемін, менадіон, цільна або гемолізована кров. Методи створення анаеробних умов. Враховуючи, що вільний молекулярний кисень є токсичним для облігатно-анаеробних бактерій, обов’язковою умовою культивування таких мікроорганізмів є обмеження його доступу. Існує ряд методів (механічних, фізичних, біологічних), які дозволяють це забезпечити. Фізичні методи. 1. Перед посівом бактерій на живильне середовище його обов’язково регенерують для видалення надлишку розчиненого кисню. З цією метою середовище кип’ятять протягом 15-20 хв на водяній бані, а потім швидко охолоджують до необхідної температури. 2. Для попередження проникненя кисню в середовище його заливають шаром стерильної вазелінової олії або парафіном. 3. Стовпчик живильного середовища у пробірках повинен бути достатньо високим (10-12 см). Кисень, як правило, дифундує в товщу стовпчика на глибину до 2 см, тому нижче створюються сприятливі умови для культивування анаеробних мікробів. 4. Евакуаційно-замісний метод полягає у використанні анаеростатів. Вони представляють собою герметичні металеві або пластмасові банки, з яких можна викачати кисень і замінити його інертним газом (гелій, азот, аргон). Допускається використання трикомпонентної газової суміші, яка складається з 80 % азоту, 10 % диоксиду вуглецю та 10 % водню. Деколи допустимим вважається використання природного газу. Для поглинання кисню, який залишається в анаеростаті, використовують паладієві каталізатори. З метою поглинання водяної пари використовують хлорид кальцію, силікагель тощо, які поміщають на дно анаеростата. Хімічні методи. 1. Використання речовин, здатних поглинати кисень. З цією метою допустимим є застосування лужного розчину пірогалолу. При цьому враховують поглинаючу активність речовини: на 100 мл ємності герметичної посудини, в якій знаходяться чашки Петрі, використовують 1 г пірогалолу і 10 мл 2,5 N розчину гідроксиду натрію. Киснезв’язуючий ефект має також гідросульфіт натрію (Na2 S O4 ). Для зв’язування кисню в 1 л повітря використовують суміш, яка складається з 100 мл свіжого 20 % розчину Na2 S2 O4 і 16 мл 50 % гідроксиду калію. 2. Застосування речовин- редуцентів. Враховуючи, що ріст облігатно-анаеробних бактерій відбувається в середовищах з низьким рівнем окисно-відновного потенціалу, до них додаються спеціальні відновлювачі: цистеїн (0,03-0,0,5 %), тіогліколеву кислоту або тіогліколат натрію (0,01-0,02 %), сульфід натрію, аскорбінову кислоту (0,1 %), різноманітні цукри. Функції відновлювачів можуть виконувати шматочки паренхіматозних органів тварин (печінка, нирки, серце) або навіть рослин (картопля, інші коренеплоди). Ступінь поглинання кисню або ступінь відновлення середовища вимірюють або електрометрично або за допомогою індикаторів (резазурин, нейтральний червоний, феносафранін). 3. Використання спеціальних газогенеруючих систем, які дозволяють створити безкисневі умови в мікроанаеростатах, транспортних пластикових пакетах тощо. Однією з найпоширеніших є система “Gas Generating Box”. До її складу входять хімічні генератори водню (борогідрит натрію) та вуглекислого газу (таблетки бікарбонату натрію та лимонної кислоти), а також паладієвий каталізатор, який поглинає кисень. Чашки з посівами поміщаються в мікроанаеростат, на дні якого знаходиться шар паладієвого каталізатору. Кінчик пакета “Gas Generating Box” надрізають ножицями, і в нього наливають 10-15 мл води. Пакет розташовують у мікроанаеростаті. Через 15-20 хв у ньому створюються анаеробні умови. Водень, який виділяється, взаємодіє з киснем, утворюючи воду, а вуглекислота продукується при взаємодії
пастерівської піпетки й ретельно перемішують, потім переносять у другу, а далі – в третю. Для застигання агару їх швидко охолоджують під струменем холодної водопровідної води. За рахунок цього живі мікробні клітини фіксуються в певних ділянка агару. Після застигання агару пробірки культивують при оптимальній температурі протягом 1-2 діб для утворення ізольованих колоній (рис. 23). Вміст кожної пробірки можна, крім того, всмоктати у пастерівські піпетки або трубки Віньяль-Вейона, стежачи, щоб не було бульбашок повітря. Останні мають довжину біля 30 см і діаметр 0,5-0,6 см. Верхній кінець їх, який закривається ватою, має перетяжку, а нижній витягнутий у вигляді капіляра. Після заповнення піпетки її витягнутий кінець запаюють і кладуть у термостат для культивування. Через 1-2 доби в агарі виростають колонії анаеробних бактерій. Для того щоб їх ізолювати, трубку надрізають напильником на певному рівні, розламують, колонію беруть бактеріальною петлею або голкою, переносять у відповідне середовище. Для виділення ізольованих колоній за методом Цейсслера матеріал із середовища Кітта-Тароцці або молока наносять петлею або 1-2 краплі пастерівською піпеткою на чашку Петрі з цукрово-кров’яним агаром і роблять посів шпателем за методом Дригальського. Не стерилізуючи шпатель, засівають другу чашку, а потім і третю. Чашки перевертають догори дном, підписують, ставлять в анаеростат, в якому створюють анаеробні умови, а потім – у термостат при температурі 37 °С на 2-3 доби. На останній чашці виростають ізольовані колонії. Третій етап дослідження починається з вивчення морфологічних особливостей колоній, які виросли в чашках Петрі або трубках Віньяль-Вейона. Досліджуються їх форма, величина, колір, характер країв, рельєф колонії, консистенція тощо. З колоній готують мазки, фарбують їх за методомГрама. Після цього колонії відсівають у середовище Кітта- Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубують певний час при оптимальній температурі. На четвертому етапі звертають увагу на особливості росту чистої культури збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту і проводять ідентифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних мікроорганізмів подібно до аеробних за морфологічними, культуральними, біохімічними та біологічними ознаками. Обов’язково використовують визначення токсигенних властивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації на лаборатор них тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості мікроорганізмів. Таким чином, на підставі вивчення різноманітних властивостей мікроорганізмів робиться висновок про належність їх до того чи іншого виду. Середовища для культивування анаеробних мікроорганізмів Середовище Кітта-Тароцці готують на основі бульйону Хоттінгера, до якого додають шматочки бичачої печінки або мяса. Стерилізують його при 1 атмосфері протягом 30 хв. Активна реакція середовища – 7,4-7,6. Після посіву матеріалу середовище заливають зверху шаром вазелінової олії товщиною до 1 см. Анаеробний кров’яний агарготують на основі еритрит-агару. До його складу входять також спеціальні добавки: середовище 199 (10 %), гемін (10 мкг/мл), твін80 (0,1 %), метадіон ( мкг/мл), цитратна кров (до 5 %) тощо. Після стерилізації його розливають у чашки Петрі. Використовують не пізніше, як через 2 год після виготовлення. Жовтковий агар. У розтоплене і охолоджене до 56 - 60 °С середовище на основі еритрит-агару додають суспензію курячого жовтка (20 %), глюкозу (0,2 %), гемін (10 мкг/мл) і розливають у чашки Петрі. Середовище використовують для визначення лецитиназної активності збудників, зокрема C. perfringens. При наявності лецитинази навколо колоній утворюються зони помутніння. Комерційне середовище для контролю стерильності. Його можна використовувати як транспортне. Для поліпшення росту анаеробних бактерій до його складу можна вводити спеціальні добавки, такі
як середовище 199, гемін, твін-80, метадіон, цитратна кров тощо. Середовище Вільсон-Блера. Його готують на основі розтопленого й охолодженого до 60 °С 1 % цукрового (глюкоза) МПА рН 7,4 з додаванням на 100 мл 10 мл стерильного 20 % розчину сульфіту натрію і 1 мл 8 % розчину хлориду заліза. Готове середовище не стерилізують. Його використовують для прискореної діагностики газової анаеробної інфекції, викликаноїClostridium рerfringens.Вже через 1-2 год спостерігають зміну середовища: воно чорніє внаслідок відновлення сульфіту натрію в сульфат, який взаємодіє з хлоридом заліза, утворюючи сульфід заліза. З’являються також розриви агару внаслідок інтенсивного газоутворення. Лакмусове молоко. Готують середовище із свіжого молока. Попередньо його кип’ятять і залишають у прохолодному місці на одну добу. Знімають верхній шар жиру і процедуру повторюють. Молоко фільтрують, і 10 % розчином бікарбонату натрію доводять рН до 7,2. Перед стерилізацією до молока додають 5-10 % лакмусової настойки та ідентичну кількість 10 % розчину бікарбонату натрію, щоб піна молока набула синьо-фіолетового відтінку. При підлужуванні молока воно стає синьо-фіолетовим, при підкислюванні – рожевим аж до червоного. Ідентифікація мікроорганізмів за допомогою бактеріофагів Бактеріофаги мають виражену літичну дію на мікроорганізми. Цю особливість використовують для визначення їх виду. З цією метою у дві пробірки з м’ясо- пептонним бульйоном засівають досліджувану культуру бактерій. Потім в одну з них додають декілька крапель індикаторного фага. Пробірки інкубують при оптимальній температурі протягом 18-24 год. Порівнюють мутність бульйону в контрольній та дослідній пробірці і роблять висновок про чутливість мікроорганізмів до літичної дії бактеріофагів. Можна з цією метою використати щільне живильне середовище, на яке газоном засівають досліджувану культуру бактерій. Після підсушування чашок на них бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять краплю відповідного розведення бактеріофагу, яке вказане на ампулі. Посіви інкубують в термостаті при 37 °С протягом 18-24 год і фіксують наявність прозорих круглих плям, які свідчать про літичну дію бактеріофагу. Позитивний результат свідчить про належність бактерій до певного виду Фаготипування мікроорганізмів проводять з метою аналізу епідеміологічної ситуації для визначення джерела інфекції. Найчастіше його виконують при діагностиці стафілококових, кишкових та інших інфекцій. В основі тесту лежить визначення фаговаріантів (фаговарів) збудників. Для цього дно чашки з м’ясо-пептонним агаром за числом бактеріофагів поділяють на квадрати. Вирощують чотиригодинну бульйонну культуру досліджуваного штаму і 1 мл її засівають на поверхню середовища. Розподіляють рівномірно культуру по поверхні середовища і надлишок її зливають. Чашку підсушують у термостаті при 37 °С протягом 30- 40 хв і на поверхню агару в кожний квадрат капають піпеткою бактеріофаги відповідних розведень. Посіви ставлять у термостат або залишають при кімнатній температурі протягом 18- 20 год, після чого оцінюють результати. Облік результатів проводять на темному фоні за допомогою лупи. Залежно від ступеня чутливості культури до бактеріофагів виділяють різні ступені лізису бактерій, який оцінюється за чотириплюсовою системою: від лізису, який зливається до його відсутності. Враховуючи, що чутливість бактерій до фагу є достатньо постійною ознакою, порівнюють фаготиии досліджуваних культур з фаготипом мікробів, який було виділено від вірогідного джерела інфекції. При їх збігу роблять висновок про виявлене джерело інфекції.
розплетення і розходження ниток. На другому етапі (ренатурація) відбувається гібридизація праймерів, тобто утворення дволанцюгових комплексів праймер-матриці, які необхідні для ініціювання синтезу ДНК. Температура суміші при цьому знижується до 55 °С. На етапі синтезу (75 °С) проходить подовження комплементарних ниток ДНК за допомогою ферменту ДНК- полімерази. Проводять 15-35 циклів синтезу. Багаторазове повторення приводить до збагачення ДНК у досліджуваному матеріалі. Метод ПЛР дуже чутливий. Його використовують для виявлення будь-якого інфекційного агента, якщо відома нуклеотидна послідовність гена (або йогофрагмента), специфічного виключно до даного збудника. Доцільно використовувати ПЛР у тих випадках, коли бактерії чи віруси мають високу мінливість і знаходяться у досліджуваному матеріалі в малій кількості (навіть одна молекула геномної ДНК). Зараз ПЛР належить до високоефективного молекулярно-генетичного методу, який доступний багатьом лабораторіям. Тривалість дослідження становить 2-3 години. Особливо доцільно використовувати його при визначенні та ідентифікації збудників туберкульозу, сифілісу, гонореї, мікоплази, вірусів СНІДу, герпесів, гепатитів, рота- та ентеровірусів
