Het doel van dit practicum was de reporteractiviteit van β-glucuronidase (GUS) bepalen, dit werd
gedaan door een fusie uit te voeren tussen de promotor van het FSD1 gen en het GUS reporter gen.
Zo kan de activiteit van GUS dat tot expressie komt onder invloed van de bestudeerde promotor
geanalyseerd worden.
Hiervoor werden transgene Arabidopsis thaliana planten gebruikt waarvan een deel blootgesteld
werden aan verhoogde cadmiumconcentraties en een deel niet.
Het FSD1 gen codeert voor een Fe superoxide dismutase vorm, de superoxidase dismutase zet
superoxide (afkomstig van oxidatieve stress door blootstelling aan cadmium) om in
waterstofperoxide dat dan verder geneutraliseerd wordt door bv. catalase. De expressie van dit gen
wordt sterk verhoogd na blootstelling aan cadmium.
De bepaling van de reporteractiviteit van GUS werd gedaan a.d.h.v. de lokalisatie en kwantificatie
van de promotoractiviteit.
De lokalisatie van de promotoractiviteit werd uitgevoerd om te zien of de promotor actief is in zowel
het blad als in de wortel, dit werd gedaan aan de hand van een X-Gluc kleuring. Bij een actieve
promotor zal glucuronidase tot expressie komen en X-Gluc knippen in een kleurloze glucuron zuur
en een blauwe neerslag (chloro-bromoindigo). Na de kleuring werd er dan verwacht bij de wildtype
zowel in het blad als in de wortel geen kleuring te vinden en bij de pFSD1-GUS planten zou er meer
kleuring moeten zijn bij de planten die blootgesteld zijn aan cadmium. Dit kwam ongeveer overeen
met het resultaat (zie Figuur 1).
De kwantificatie van de promotoractiviteit werd gedaan door middel van MUG ASSAYS. GUS gaat
MUG (4-methylumbelliferyl β-D-glucoronide) knippen in glucuron zuur en fluorescerend 4-
methylumbelliferyl. De fluorescentie werd dan gemeten en met deze waarden kan dan de activiteit
berekend worden. Deze waarden werden dan statistisch getest met een t-test om te zien of het
verschil significant is met als resultaat dat de gemiddelde promotoractiviteit van de behandelde
groep en de controle groep niet verschilt (p-waarde groter dan s.n. 5%) wat wil zeggen dat
cadmium geen effect heeft op de promotoractiviteit.
Uit deze analyse kan er besloten worden dat verhoging van de expressie, na blootstelling aan
cadmium, wat duidelijk is na de kleuring, waarschijnlijk niet het gevolg is van een verhoogde
promotoractiviteit maar eerder aan een verhoogde mRNA stabiliteit.
Figuur SEQ Figuur \* ARABIC 1 kleuring blad + stengel met X-Gluc
Figuur 2 gemiddelde promotoractiviteit controlestalen en behandelde stalen (in pmol/min/mgproteïne
♦Practicum: Het bepalen van β-glucuronidase reporteractiviteit
Leyla Kodalci
3e bach biologie