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Determinación de la Actividad Antimicrobiana del Extracto de Prosopis glandulosa, Thesis of Biochemistry

Un experimento científico que investiga la actividad antimicrobiana del extracto de prosopis glandulosa (mezquite) contra la bacteria escherichia coli. El estudio evalúa la efectividad del extracto etanólico y acuoso en diferentes concentraciones, utilizando métodos de cultivo y análisis microbiológicos. Los resultados del experimento proporcionan información sobre el potencial del mezquite como agente antimicrobiano.

Typology: Thesis

2024/2025

Uploaded on 09/10/2024

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“DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE
EXTRACTO ETANÓLICO DE SEMILLAS DE MEZQUITE.
(Prosopis glandulosa).
Autores: Yajaira Michel Valencia Vázquez (e.g Ingrid Ariadna Hernandez
Martínez, e.g Sagrario Jazmín Bernardino de la Cruz) Ing. Nayeli Castañeda
Cuevas, Dr. Luis Reyes Nava.
Introducción
En los últimos años, se han realizado un gran número de investigaciones en
la búsqueda de nuevos ingredientes de origen natural para la creación de
aditivos con actividad antimicrobiana y ser utilizados en el desarrollo de
nuevos productos alimenticios (Falowo et al., 2014). Por lo tanto, en base a
la necesidad existente por la obtención de nuevos agentes conservadores
naturales y seguros, uno de los principales objetivos de la industria
farmacéutica y de los alimentos es el desarrollo de aditivos a partir de ciertas
especies de plantas medicinales y comestibles, capaces de reducir o inhibir
la formación de radicales libres, los cuales están estrechamente asociados
con enfermedades, incluyendo cáncer, aterosclerosis y diabetes (Fernández-
Ginés et.al., 2005); y con reacciones de oxidación de lípidos, que junto con
el deterioro microbiano son la causa principal de pérdida de calidad en los
alimentos (Faustman et al., 2010). El mezquite es una planta
tradicionalmente utilizada por el hombre y animales como alimento en
ciertas regiones de México. Además, también es considerada medicinal
debido a que posee ciertas propiedades biológicas, las cuales son atribuidas
a la presencia de fitoquímicos como los compuestos fenólicos. en algunas
investigaciones se ha encontrado que los extractos obtenidos de las hojas de
mezquite poseen propiedades biológicas, entre las que se mencionan
actividad antifúngica, antimicrobiana, analgésica, citotóxica,
antiinflamatoria, antitumoral, antiviral, anti alergénica, antidiarreica,
antidiabética y antioxidante, las cuales están relacionadas con la presencia
de alcaloides y compuestos fenólicos; de estos últimos se reportan apigenina,
catequina, juliflora, quercetina, kaempferol y mezquitol (SivaKuamara et al.,
2009; Prabha etal.,2014)(Ramírez,Rojo)
Objetivos
a. General
Caracterizar la actividad antimicrobiana del extracto etanólico de la
semilla de mezquite (prosopis glandulosa).
b. Específicos
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“DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE

EXTRACTO ETANÓLICO DE SEMILLAS DE MEZQUITE.

(Prosopis glandulosa).” Autores: Yajaira Michel Valencia Vázquez (e.g Ingrid Ariadna Hernandez Martínez, e.g Sagrario Jazmín Bernardino de la Cruz) Ing. Nayeli Castañeda Cuevas, Dr. Luis Reyes Nava. Introducción En los últimos años, se han realizado un gran número de investigaciones en la búsqueda de nuevos ingredientes de origen natural para la creación de aditivos con actividad antimicrobiana y ser utilizados en el desarrollo de nuevos productos alimenticios (Falowo et al., 2014). Por lo tanto, en base a la necesidad existente por la obtención de nuevos agentes conservadores naturales y seguros, uno de los principales objetivos de la industria farmacéutica y de los alimentos es el desarrollo de aditivos a partir de ciertas especies de plantas medicinales y comestibles, capaces de reducir o inhibir la formación de radicales libres, los cuales están estrechamente asociados con enfermedades, incluyendo cáncer, aterosclerosis y diabetes (Fernández- Ginés et.al., 2005); y con reacciones de oxidación de lípidos, que junto con el deterioro microbiano son la causa principal de pérdida de calidad en los alimentos (Faustman et al., 2010). El mezquite es una planta tradicionalmente utilizada por el hombre y animales como alimento en ciertas regiones de México. Además, también es considerada medicinal debido a que posee ciertas propiedades biológicas, las cuales son atribuidas a la presencia de fitoquímicos como los compuestos fenólicos. en algunas investigaciones se ha encontrado que los extractos obtenidos de las hojas de mezquite poseen propiedades biológicas, entre las que se mencionan actividad antifúngica, antimicrobiana, analgésica, citotóxica, antiinflamatoria, antitumoral, antiviral, anti alergénica, antidiarreica, antidiabética y antioxidante, las cuales están relacionadas con la presencia de alcaloides y compuestos fenólicos; de estos últimos se reportan apigenina, catequina, juliflora, quercetina, kaempferol y mezquitol (SivaKuamara et al., 2009; Prabha etal.,2014)(Ramírez,Rojo) Objetivos a. General Caracterizar la actividad antimicrobiana del extracto etanólico de la semilla de mezquite (prosopis glandulosa). b. Específicos

  1. Obtener el extracto etanólico de la semilla de mezquite (prosopis glandulosa).
  2. Evaluar la actividad antimicrobiana del extracto etanólico de la semilla de mezquite (prosopis glandulosa). Métodos Siembra de E. COLI por estría masiva. Materiales
    • Cultivos puros de bacterias
    • Escherichia coli
    • Microscopio
    • Mecheros
    • Gradillas
    • Asas bacteriológicas
    • Vaso de precipitados de 250mL
    • Un juego de colorantes de Gram
    • Cajas de Petri con Agar MRS.
    • Micropipetas
    • Puntas de pipeta
    • Portaobjetos Se prepararon 170 ml de agar MRS y se procedió a esterilizar el medio de cultivo y todo el material a utilizar. Una vez que se esterilizó se procedió a vaciar el medio de cultivo en las cajas petri y dejar que se gelificar. Posteriormente se procedió a sembrar la bacteria de E. COLI que se encontraba en conservación en caldo con glicerol con una asa bacteriológica o con un hisopo previamente esterilizado. Se procede a inocular y sembrar la bacteria, pasando el hisopo o la asa por toda la caja petri hasta quedar bien cubierta con la bacteria. Una vez que se hizo la siembra de forma de estriado masivo se sellaron las cajas petri y a rotularlas para poderlas colocar en la incubadora a una temperatura de 37 °C durante 48 horas. Tinción de Gram Inicialmente realizaremos una observación directa del cultivo mixto al microscopio mediante la llamada tinción de Gram. Esta prueba es fundamental en la clasificación de los microorganismos ya que permite establecer diferencias morfológicas y estructurales de la pared. Se tendrá que

Procedimiento Pesamos 1,6g de caldo nutritivo en la balanza. A continuación, ponemos 31,82 ml de glicerol en una probeta. Ponemos 168,18 ml de agua destilada para llegar a los 200 ml requeridos para el medio y removemos el contenido de la probeta con una varilla de vidrio. Con cuidado, vamos echando el glicerol sobre el vidrio de reloj, para que el caldo nutritivo caiga al tarro, donde lo mezclaremos todo. Una vez que tanto el caldo nutritivo como la mezcla de agua y glicerol estén en el tarro, moveremos la mezcla con la varilla de vidrio para homogeneizarla. Una vez homogeneizado, lo meteremos al autoclave. Una vez se hayan enfriado, cogeremos unos tubos Eppendorf y unas micropipetas de 1.000 microlitros, puntas de pipeta estériles, gradilla y lo llevaremos a la campana, procederemos a poner 1 ml del medio en cada uno de los tubos Eppendorf, hasta que este se acabe. (Ocares P, Castro F. 2010). El caldo preparado se colocó en una de las cajas petris para poder despegar con una asa bactereologica las colonias de la bacteria que crecieron en la caja petri, después de haber despegado las colonias se vierte el caldo en otra caja petri y así susecivamente hasta terminar con todas las cajas petris, para posteriormente pasar 1 ml del caldo con E.COLI, en tubos Tubos Eppendorf estériles y poder colocarlos en congelación con una temperatura de - 80 °C y

  • 196 °C, con tiempo indeterminado. Preparación de los extractos. Materiales
    • Molino para granos
    • Rotavapor
    • Embudo separador de fases
    • Balanza digital
    • Probeta
    • Vasos de precipitados 100 ml y de 250 ml
    • Frascos de cristal de 500 ml
    • Agitadores magnéticos
    • Placa agitadora 32
    • Termómetros
    • Agua destilada
    • Etanol
    • Centrífuga
    • Papel filtro Watman
    • Tubos Falcon f.

Procedimiento Se molieron las semillas de Prosopis glandulosa en un molino para granos, hasta dejar un polvo muy fino y se almacenó a 4 °C hasta preparar los extractos. Se mezclaron 25 g de polvo en 250 ml de agua destilada para el extracto acuoso, y para el extracto etanólico se mezclaron 25 g de polvo en 250 ml de etanol al 70%, luego se transfirió en frascos ámbar y se pusieron en agitación a 50 rpm durante 7 días. Posteriormente se filtraron los extractos para eliminar las impurezas y se colocaron en tubos falcon de 15 ml para pasar a centrifugar y poder separar el extracto. Después se extrajo el sobrenadante de los tubos falcon y se colocó en vasos precipitados para meterlos a una estufa de secado para poder eliminar el etanol en una temperatura de 40 °C durante 48 hrs. El extracto obtenido se guardó en congelación hasta ser utilizado. El extracto etanólico obtenido se colocó en tubos falcon para guardarlos en congelación hasta su utilización. Actividad antimicrobiana Materiales

  • Agua destilada.
  • Agar MRS.
  • Cajas de petri.
  • Micropipetas.
  • Campana.
  • Gradilla.
  • Probeta.
  • Balanza.
  • Hisopos estériles
  • Cucharilla.
  • Punta de pipetas estériles.
  • Frascos de 250 ml.
  • Etanol al 70%.
  • Autoclave.
  • Incubadora Para realizar los análisis de la actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos y del acuoso de P. glandulosa, se usó la metodología de difusión de agar, donde se prepararon las cajas con AGAR MRS. Una vez secas las cajas se sembró la E. coli con hisopo esteril, cuando la bacteria ya se había secado se dividieron las cajas en 4 para poder colocar microgotas de 5 μl de los extractos en cada división.

bacteria ya la tenían identificada que era un serotipo de la E. coli y que se trata del serotipo O157:H7. A Continuación se puede observar la factibilidad de cada uno de los extractos. Crecimiento microbiano que tuvieron los diferentes extractos Extracto etanolico 1: Hay presencia de E. coli. en la caja, pero donde se colocó la microgota de 5 μL del extracto etanólico, se observa que el crecimiento microbiológico disminuye. Extracto etanolico 2: Se observa que hay presencia de E. coli. en la caja al igual que otro tipo de contaminación como algunos hongos. También se logra apreciar que donde se colocó la microgota del extracto etanólico al que si se le eliminó el etanol, se observa como el crecimiento microbiológico disminuye en algunas de las zonas de la caja. Acuoso: Se puede observar que en la caja hay crecimiento de E. coli y hongos. También se logra apreciar que el efecto del extracto sobre la E. coli es mínimo por lo que no inhibe el crecimiento de la bacteria. Para poder determinar cuál era el extracto es el que mayor efecto antimicrobiano tiene sobre la E. coli 0157: H7, se hicieron diferentes análisis microbiológicos donde nomas se analizaron 2 extractos, el acuoso y el etanólico al que se le eliminó el etanol. Al extracto etanólico que no se le eliminó el etanol se descartó por el efecto que hace el etanol sobre la bacteria. Se usaron diferentes concentraciones para poder determinar cual será el más eficiente. Crecimiento microbiano que tuvieron los extractos etanólico 2 y acuoso con diferentes concentraciones Etanolico 2:

  • concentración al 25 μL El crecimiento microbiano que se detectó en esta concentración fue mayor a la primera que se hizo con una concentración de 5 μL.
  • Concentración al 50 μL En esta concentración no se detectaron diferencias en comparación con la primera.
  • Concentración al 75 μL El crecimiento microbiano que se detectó en esta concentración fue un poco mayor a la segunda donde se usaron 50 μL.
  • Concentración al 100 μL En esta concentración que se utilizó se observó un mayor efecto del extracto con la bacteria de E. coli. Acuosa:
  • Concentración al 25 μL, 50 μL, 75 μL y al 100 μL: Se observó que con las concentraciones que se usaron para el extracto acuoso no hubo diferencia de crecimiento entre cada una de las concentraciones, solo se aprecia un poco en la de 100 μL. Se observa que el extracto acuoso no tiene gran efecto sobre la bacteria de E. coli, y en la placa también se observa crecimiento de algún tipo de hongo. Después de determinar que el extracto etanólico al que se le eliminó el etanol era el que tenía mayor efecto antimicrobiano, se procedió hacer un nuevo análisis con él y con diferentes concentraciones para poder cumplir con los objetivos propuestos anteriormente Crecimiento microbiano que tuvo el extracto etanólico 2 con diferentes concentraciones.
  • Etanolico 2 con concentraciones de 125μL, 150 μL, 175 μL y 200 μL: Se observa que en el crecimiento microbiano si disminuye a comparación de las concentraciones anteriores, pero en la que más se observó efecto fue en la concentración de 200 μL. Conclusión. Con los resultados encontrados durante la investigación, nos percatamos que el mezquite tiene una composición que lo hace tener propiedades antimicrobianas, es decir que hay un efecto antimicrobiano que impide el crecimiento microbiológico, por lo que el mezquite se pudiese implementar como un conservador natural. Los análisis también nos arrojan resultados que indican que el mezquite si tiene efecto sobre la bacteria E. coli 0157: H7 pero el efecto que tiene sobre ella es mínimo, por lo que hace que no tenga tanto impacto como conservador en alimentos donde se pueda crecer con mayor facilidad como son las carnes crudas o las carnes mal cocinadas. Con los resultados obtenidos nos da la posibilidad de hacer investigaciones futuras sobre el mezquite, ya sea seguir mirando la parte microbiológica o también se pueden ver la parte de los metabolitos secundarios donde se puede determinar si el mezquite contiene algún efecto de antioxidante, donde se pueda utilizar como un